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研究目的：肝癌是我国临床上常见的恶性肿瘤,转移及死亡率较高,预后差。上皮来源的细胞在脱离基质附着后引起的细胞死亡称为失巢凋亡,而抵抗失巢凋亡是肿瘤细胞的一大标志。脱离附着的肿瘤细胞倾向于聚集成团逃避凋亡,成为肿瘤细胞转移的关键步骤,而参与其中的分子则成为研究和控制肿瘤转移的重要靶点。作为一类重要的基因表达调控因子,microRNA在肝癌细胞失巢凋亡中的作用尚未完全阐明。本研究旨在探讨在失巢后的肝癌细胞中异常表达的miR-424-5p在肝癌细胞抵抗失巢凋亡及相关上皮向间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)等恶性行为中的作用效应与分子机制。材料方法：1.失巢凋亡抵抗相关microRNA的筛选1.1芯片结果分析对脱离基质附着前后的肝癌细胞的microRNA表达谱进行芯片检测,分析脱离基质的肝癌细胞中表达失调的microRNA。1.2检测失巢凋亡抵抗的肝癌细胞中miR-424-5p表达应用Real-time PCR验证microRNA microarray分析的数据,进一步分析miR-424-5p在脱离基质附着前后的肝癌细胞中的表达变化。2.检测肝癌细胞失巢前后EMT相关基因表达差异对发生失巢凋亡抵抗的肝癌细胞中,检测EMT相关基因的表达。3. miR-424-5p对抵抗失巢凋亡相关恶性行为的作用效应miR-424-5p对肝癌细胞进行转染,然后进行脱离附着24h,收集脱离附着的肝癌细胞的总蛋白,检测转染miR-424-5p前后EMT相关分子在mRNA和蛋白水平的表达变化,western blot检测caspase3相关凋亡通路的活性；流式细胞术检测细胞凋亡；Transwell实验检测转染miR-424-5p转染前后失巢的肝癌细胞侵袭力的变化；并进行失巢后细胞克隆形成能力的检测。4. miR-424-5p的靶基因预测与分析生物信息学预测miR-424-5p的可能靶基因,分析与肝细胞癌恶性行为相关的靶基因,选择出ICAT、Bc1212、DICER等基因作为miR-424-5p的潜在靶点。4.1miR-424-5p对靶基因的作用验证在肝癌细胞中进行miR-424-5p的转染,并检测靶基因的表达水平,由此对筛选出的潜在靶基因进行调控效应验证；并应用荧光素酶报告基因体系检测miR-424-5p与ICAT等潜在靶基因3’UTR区的预测靶序列的结合。4.2miR-424-5p对失巢凋亡抵抗相关恶性行为的作用效应向肝癌细胞中转入miR-424-5pmimics,通过免疫共沉淀以及westernblot检测细胞粘附关键分子E-cadherin/β catenin复合物的表达以及EMT相关的恶性行为。通过对肝癌细胞进行ICAT真核表达载体及小干扰RNA(Sma11interfering RNA, siRNA)的转染,从正反向明确miR-424-5p对肝癌细胞的作用效应是否通过ICAT介导。5.临床肝癌患者组织标本中miR-424-5p、其靶基因以及EMT相关蛋白的检测Real-time PCR检测肝癌患者癌组织以及非癌组织中miR-424-5p及其靶基因的表达,以及EMT相关蛋白的表达,并分析各蛋白表达水平及其与临床指标的相关性。6.临床肝癌患者血清miR-424-5p的检测与分析收集临床血清样本,检测肝癌患者与正常人外周血血清中miR-424-5p的表达水平及其与临床指标的相关性,并进一步分析miR-424-5p在肝癌中的作用效应。研究结果：1. miR-424-5p在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中表达下调芯片结果显示,在发生失巢凋亡抵抗的肝癌细胞中miR-424-5p的表达水平显著下调。Real-time PCR在三种肝癌细胞中进行验证,证实了miR-424-5p在失巢后的肝癌细胞中显著性表达下调。2.肝癌细胞在脱离附着过程中表现出上皮向间质转化行为脱离附着的肝癌细胞中,E-cadherin等上皮细胞表型蛋白表达下调,而代表间质表型相关蛋白的N-cadherin,波形蛋白等表达上调,分别通过RealtimePCR和Western Blot进行EMT相关标记物的mRNA和蛋白水平的检测,同时进行EMT相关的生物学行为检测,结果提示失巢后的肝癌细胞发生了EMT相关的恶性转化。3. miR-424-5p逆转肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗及其恶性行为。miR-424-5p促进肝癌细胞的失巢凋亡；通过逆转肝癌细胞EMT行为降低其侵袭力；对肝癌细胞失巢后的克隆形成也有抑制作用。同时,miR-424-5p对贴壁肝癌细胞的生物学效应体现为引起细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,以及降低克隆形成能力。4. I CAT是miR-424-5p的直接靶基因用miR-424-5p对肝癌细胞进行转染,结果显示miR-424-5p能够下调ICAT在肝癌细胞中的表达。报告基因分析显示,ICAT是miR-424-5p的直接靶基因。进一步的细胞实验显示,miR-424-5p能够促进E-cadherin和β-catenin复合物的形成,促进细胞粘附,抑制间质细胞蛋白的表达；而ICAT的作用则相反,表现为促进细胞的侵袭转移,提示miR-424-5p通过靶向ICAT对肝癌细胞发挥抑制效应。5.临床肝癌组织中证实miR-424-5p靶向I GAT抑制肝癌进展与非癌肝组织相比,miR-424-5p在肝癌组织中表达显著下调,与病理分级和临床分期呈负相关；并且miR-424-5p在转移患者中的表达水平显著低于原位癌患者,提示miR-424-5p在肝癌组织中的表达失调参与了肝癌进展。miR-424-5p与ICAT在肝癌中的表达水平呈负相关,临床标本中的检测进一步说明ICAT是miR-424-5p的直接靶基因。6.肝癌患者血清中miR-424-5p表达下调miR-424-5p在正常人、原位癌、转移癌患者外周血清中的表达水平依次显著性下调,并且与临床分期负相关,提示miR-424-5p在肝癌患者血清中的表达下调参与了肝癌的发生与进展。结论：1.肝癌细胞在脱离基质附着后能够发生上皮向间质转化,并通过EMT相关的恶性转化,介导其对失巢凋亡的抵抗效应。2. miR-424-5p在脱离附着的肝癌细胞中表达下调,并通过直接靶向ICAT,促进E-cadherin和β-catenin复合体的表达和细胞间粘附,逆转EMT相关的恶性行为,并进一步逆转肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗。3. miR-424-5p在肝癌患者组织标本和血清标本中均显著性下调,并且其表达水平与患者的临床分期和病理分级负相关,提示miR-424-5p在肝癌患者中的表达失调参与了疾病的进展。创新性及意义：1.本课题首次证实失巢后的肝癌细胞能够通过发生上皮向间质转化行为抵抗失巢凋亡。2.本课题首次证实miR-424-5p通过直接靶向ICAT逆转肝癌细胞EMT相关的恶性行为和对失巢凋亡的抵抗,发挥抑制肿瘤进展的作用。3.本课题首次证实miR-424-5p在肝癌患者的组织标本和血清中表达下调,并且与临床分期及病理分级负相关,提示miR-424-5p的表达失调参与了肝癌的发生与进展。