葛根素对同型半胱氨酸诱导H9c2心肌细胞损伤的影响及其机制研究

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背景与目的:在心肌缺血/再灌注损伤、心肌炎、心肌肥厚及心力衰竭等多种心血管疾病的发生发展中常伴随心脏功能障碍,心肌细胞损伤是其重要的病理基础。抑制氧化应激、钙超载、心肌细胞凋亡等,继而改善心脏功能紊乱,是发挥心脏保护作用的研究热点。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是甲硫氨酸代谢过程产生的含硫非必需氨基酸,是心血管疾病发生的独立危险因素。持久的血清高浓度Hcy可诱导氧化应激及心肌细胞凋亡,促进心脏纤维化,加速心脏重构,导致心肌功能受损,最终引发心脏功能障碍。葛根素(puerarin,Pue)是从中药葛根中分离出来的一种异黄酮类衍生物,可通过抗氧化、抗心肌凋亡和抗心肌纤维化等作用减轻多种风险因素诱导的心肌损伤从而改善心脏功能,在保护缺血心肌和抗心肌缺血再灌注损伤、减少急性心肌梗塞面积等方面有良好作用。然而,目前尚无实验探究葛根素对同型半胱氨酸诱导损伤的心肌细胞的保护作用及其可能的分子机制。本研究在大鼠H9c2心肌细胞体系中,探究葛根素对同型半胱氨酸诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用及其可能机制,为葛根素的心肌保护作用的应用提供新的思路。方法:体外培养大鼠H9c2心肌细胞,于培养体系中分别加入不同浓度Hcy(0~8 mM)处理24 h。光学显微镜下观察H9c2细胞形态变化情况,CCK-8试剂盒进行细胞活性测定,LDH法检测细胞毒性,Annexin-VFITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡,微板法检测细胞内ROS水平,以建立Hcy诱导的H9c2细胞损伤模型。之后在加入Hcy的损伤体系中,提前孵育葛根素进行干预,用同样的方法测定上述指标的变化。另外,用TBA法检测细胞内丙二醛(MDA)水平,WST法检测总超氧化物歧化酶(SOD)水平,Seahorse生物分析仪检测线粒体呼吸功能,实时定量PCR法测定Nrf2及HO-1 mRNA表达水平,Western blot免疫印迹法检测 Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2 及 cleaved caspase-3 等蛋白的表达水平,以探究葛根素对Hcy损伤条件下H9c2细胞的保护作用。最后,通过使用HO-1特异性阻断剂(Znpp)和P13K特异性阻断剂(LY294002)抑制HO-1及PI3K的激活,探究葛根素抑制Hcy诱导H9c2心肌细胞的损伤及产生心肌保护作用的可能机制。结果:(1)Hcy可浓度依赖性降低H9c2细胞活力,增加LDH释放,引起氧化损伤,诱导细胞凋亡;(2)葛根素预处理可以提高H9c2细胞活力,降低LDH渗漏和细胞凋亡率,提高SOD水平,降低MDA水平,减少氧化应激,改善线粒体呼吸功能。同时葛根素能够降低Bax/Bcl-2比率和cleaved caspase-3蛋白表达水平,促进Nrf2和HO-lmRNA及蛋白表达;(3)Hcy可减少p-Akt的表达,葛根素预处理后增加p-Akt的表达。PI3K抑制剂(LY294002)可以阻断葛根素诱导Nrf2和HO-1表达增强及增加细胞活力的作用;HO-1抑制剂(Znpp)可以逆转葛根素降低Bax/Bcl-2比率、cleaved caspase-3表达及增加细胞活力的作用。结论:本研究成功建立了Hcy诱导H9c2心肌细胞损伤模型。葛根素预处理可以抑制Hcy诱导的H9c2心肌细胞的损伤,改善心肌线粒体呼吸功能。葛根素通过减少氧化应激,抑制细胞凋亡发挥心肌保护作用,这可能与激活PI3K/Akt-Nrf2/HO-1信号通路相关。
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