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目的：间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一类能够从骨髓、脂肪、羊膜和牙髓等多种组织分离的干细胞。由于其具有多向分化潜能,不表达人白细胞抗原DR位点(Human leukocyte antigen-antigen D related, HLA-DR)、 CD45等细胞表面标志的低免疫原性,以及向损伤组织、肿瘤部位归巢和促进组织再生的特性,以MSCs为主的干细胞治疗有望成为肿瘤和一些自体免疫疾病的新型治疗手段。目前已证明MSCs在体内外能够分泌细胞因子,调节肿瘤细胞的相关信号通路,进而抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡。其中,NF-κB信号通路也参与了该过程,然而完整的抑制机制目前尚未见报道。起源于皮肤、黏膜和中枢神经系统的黑色素瘤中有50%的病例与BRAF基因突变有关。该基因突变的发生导致白介素-1(Interleukin-1, IL-1)持续激活NF-κB信号通路,使得黑色素瘤细胞细胞周期失控,进而导致了肿瘤的形成和发展。有研究证明MSCs能够分泌IL-1的受体拮抗剂(Interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra),而IL-1Ra可以特异性地抑制IL-1激活NF-κB信号通路。由此推断,MSCs可能通过此路径抑制黑色素瘤细胞的增殖。鉴于此,本论文将MSCs、IL-1Ra、NF-κB和黑色素瘤结合起来,探究MSCs对黑色素瘤细胞的抑制作用及其基于NF-κB的抑制机制,为肿瘤的临床治疗提供实验依据,拓展干细胞的应用范围。方法：首先,利用transwell进行MSCs与黑色素瘤A375细胞共培养实验,检测MSCs是否对A375细胞有抑制作用。其次,利用条件培养基(Conditioned medium, CM)实验,检测在无肿瘤的刺激和接触下,MSCs通过分泌细胞因子对A375细胞增殖产生的抑制作用。随后对MSCs CM培养的A375细胞进行细胞周期的流式细胞仪检测,探究MSCs是抑制A375细胞增殖还是促进A375细胞凋亡作用。 Western Blot检测了CM实验中A375细胞的NF-κB信号通路相关蛋白的表达。然后根据GeneBank上IL-1Ra的序列设计引物,利用反转录聚合酶链式反应(Reverse tran-scription polymerase chain reaction, RT-PCR)验证IL-1Ra在MSCs中的表达,同时利用得到的IL-1Ra片段构建了IL-1Ra的过表达载体pcDN A3.1-EGFP-IL-1 Ra和沉默载体pGPH1-IL-1Ra,转染入MSCs,并利用Western Blot实验同时检测了正常MSCs、过表达IL-1Ra的MSCs (MSCs-O)和沉默了IL-1Ra表达的MSCs (MSCs-S)中IL-1Ra的表达水平。随后,获取MSCs-O和MSCs-S的CM,利用不同浓度的CM进行条件培养基实验,观察过表达或沉默IL-1Ra后对A375细胞增殖的抑制情况。同时对CM培养的A375细胞再次进行细胞周期的检测。然后探究了MSCs-S和MSCs-O的CM培养的A375细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达情况。最后进行了裸鼠异位瘤实验,分别共注射MSCs或MSCs-S或MSCs-O和A375细胞,观察肿瘤形成情况,测量肿瘤体积,并进行苏木精-伊红组织切片染色(Hematoxylin-eosin staining, H&E)。结果：transwell共培养实验结果证明,MSCs在非直接接触的条件下对黑色素瘤A375细胞增殖具有抑制作用,在MSCs与A375细胞比例为5：1培养72 h时抑制率最高,达到38.93%,且随着处理时间的延长抑制率也随之增加(p<0.001)。CM实验结果证明,MSCs通过分泌可溶性细胞因子抑制A375细胞而不必与肿瘤细胞直接接触刺激；100%的MSCs CM对A375细胞培养72 h,抑制率最高,达到26.50%,但抑制率随着培养时间的延长并无明显变化。细胞周期实验证明,MSCs引起A375细胞的G1期阻滞,造成A375细胞增殖受到抑制,当处理时间为72 h时,80%MSCs CM组的G1期细胞数与对照组G1期细胞数相比差异极显著(p<0.001)；而Western Blot实验结果证明,该抑制作用的发生与NF-κB信号通路相关蛋白表达下调有关。利用IL-1Ra片段构建瞬时过表达载体pcDNA3.1-EGFP-IL-1Ra和沉默载体pGPH1-IL-1Ra转染入MSCs得到的MSCs-O和MSCs-S能够有效地提高和抑制IL-1Ra的表达水平。MSCs-S的CM实验结果证明,与MSCs的CM实验结果相比,IL-1Ra表达受到沉默后,MSCs-S对A375细胞的抑制作用降低,抑制率也降低到14.25%；IL-1Ra过表达后,MSCs-O对A375细胞的抑制作用增强,且最高抑制率也提高到31.49%。细胞周期实验结果证明与MSCs的CM组相比MSCs-O提高了A375细胞在G1期的细胞数(p<0.05)；而与MSCs的CM组相比,在处理72 h后,MSCs-S明显减少了A375细胞在G1期的细胞数(p<0.01)。NF-κB信号通路的相关蛋白p65和TRAF6表达也随着IL-1Ra的表达水平提高而降低,当IL-1Ra表达被沉默后p65与TRAF6表达水平则提高。体内实验证明,IL-1Ra的表达水平影响肿瘤的形成和大小,分别共注射MSCs、MSCs-S、MSCs-O和A375细胞28 d后,MSCs-O组与MSCs-S组、MSCs组和A375组相比肿瘤体积差异极显著(p<0.001)；H&E染色结果证明,MSCs、MSCs-O和MSCs-S与其他对照组相比纤维样组织更多,且肿瘤包膜更明显。结论：本研究通过体内外实验,明确了MSCs对黑色素瘤A375细胞增殖的抑制作用。MSCs通过分泌IL-1Ra下调了黑色素瘤A375细胞的NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平,从而引起了A375细胞G1期阻滞,进而抑制了其细胞增殖。因此本研究为肿瘤的有效、可控的临床治疗提供实验依据,拓展了MSCs的临床应用范围。