[研究目的]从细胞及分子水平,探讨ERK信号通路在高糖诱导周围神经系统髓鞘损伤中的作用以及槲皮素、桂皮醛、水蛭素及单体组合的干预作用。[研究方法]1.采用改良消化复合植块法培养雪旺细胞(Schwann cells, SCs), S-100免疫荧光染色法鉴定细胞纯度,并比较改良消化复合植块法与经典植块法、普通消化复合植块法获取SCs数量和纯度。2.分别采用CCK-8法和Hoechst染色法检测50 mmol/L (mM)、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM高糖培养24h、48h、72h、96h对SCs增殖和凋亡的影响。通过Western Blot和实时荧光定量PCR法分别检测50 mM高糖培养24h、 48h、72h、96h对SCs P0、p-ERK、ERK蛋白表达和P0、Krox-20、MAG mRNA表达的影响。3.槲皮素(Q,高中低浓度)、水蛭素(H)、桂皮醛(C)、槲皮素+水蛭素组合(QH)、槲皮素+桂皮醛组合(QC)、水蛭素+桂皮醛组合(HC)、槲皮素+水蛭素+桂皮醛组合(QHC)和10μM ERK通路抑制剂U0126分别干预50 mM高糖培养的SCs72h, CCK-8法检测增殖率,免疫荧光染色法检测periaxin表达,Western Blot检测P0、p-ERK、ERK、p-c-Jun、c-Jun、NICD的蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测P0、Krox-20、MAG、Notch1、Jagged1 mRNA表达,ELISA法检测CNTF的分泌水平。4.采用混合酶分步消化法培养背根神经节神经元(dorsal root ganglion neuron, DRGn), MAP-2免疫荧光染色鉴定DRGn纯度。将纯化后的SCs接种在DRGn上,建立共培养体系。采用MBP免疫荧光染色检测髓鞘形成。通过Western Blot和实时荧光定量PCR法分别检测50 mM高糖培养DRGn/SCs共培养体系3d、5d、7d对MBP、MAG、p-ERK、ERK蛋白表达和MBP、MAG mRNA表达的影响。5.Q(高中低浓度)、H、C、QH、QC、HC、QHC和U0126分别干预50 mM高糖培养的DRGn/SCs共培养体系7d, MBP免疫荧光染色检测髓鞘节段的数目和长度,MAG与p-ERK免疫荧光双染检测共培养体系中SCs p-ERK的表达,Western Blot检测p-ERK、ERK、MBP和MAG蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测MBP和MAG mRNA表达。[研究结果]一、改良消化复合植块法可提高获取SCs的数量和纯度改良消化复合植块法获取的细胞数量和纯度均较普通消化复合植块法和经典植块法显著提高(P<0.01)。二、不同高糖培养条件对SCs的损伤作用72h时,与CON组比较,50mM-150mM HG组细胞增殖率均明显降低,细胞凋亡率均显著增加(p<0.01),SCs的增殖率与葡萄糖浓度呈负相关(P<0.01),凋亡率与葡萄糖浓度呈正相关(P<0.01)。72h时,与CON组比较,50mM HG PO蛋白表达及P0、Krox-20和MAG mRNA均显著降低(P<0.01), ERK蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01)。三、槲皮素可抑制高糖条件下ERK通路介导的SCs成髓鞘损伤1.槲皮素可缓解高糖对SCs增殖和分化及CNTF分泌的抑制与CON组相比,HG组细胞增殖率、periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均显著降低(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显著升高(P<0.01); SCs增殖率、periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均与槲皮素的剂量呈正相关(P<0.01)。2.槲皮素可抑制高糖条件下SCs的髓鞘蛋白和mRNA表达的下调与CON组相比,HG组P0蛋白和P0、Krox-20、MAGmRNA表达均显著降低(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组SCs的P0蛋白和P0、Krox-20、 MAG mRNA表达均显著升高(P<0.01)；P0蛋白和P0、Krox-20、MAGmRNA表达均与槲皮素的剂量呈正相关(P<0.01或P<0.05)。3.槲皮素可抑制高糖条件下SCs ERK通路的激活和其下游髓鞘负性调控因子c-Jun和Notch通路的活化与CON组相比,HG组SCs的ERK蛋白磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均显著升高(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显著降低(P<0.01); ERK蛋白磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均与槲皮素的剂量呈负相关(P<0.01)。四、槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下ERK通路介导的SCs成髓鞘损伤1.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可缓解高糖对SCs增殖和分化及CNTF分泌的抑制与HG组相比,各干预组的细胞增殖率、periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均升高,差异显著(P<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显著降低(P<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平明显降低(P<0.05或P<0.01),与QC组相比,Q3和C3组CNTF分泌水平均显著降低(P<0.01),C3组periaxin阳性细胞比例显著降低(p<0.01),与HC组相比,H3组和C3组periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平均显著降低(p<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组periaxin阳性细胞比例和CNTF分泌水平显著降低(P<0.01)。2.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下SCs的髓鞘蛋白和mRNA表达的下调与HG组相比,各药物干预组P0蛋白和P0、Krox-20、MAG mRNA表达均升高,差异显著(P<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均降低,差异有统计学意义(p<0.05或P<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组明显降低(P<0.05或P<0.01),与QC组相比,C3组显著降低(P<0.01),与HC组相比,H3组和C3组均显著降低(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组显著降低(p<0.01)。3.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下SCs ERK通路的激活和其下游髓鞘负性调控因子c-Jun和Notch通路的活化与HG组相比,各药物干预组ERK磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均降低,差异显著(p<0.01)；与QHC组相比,QC、QH、HC组及Q3、H3、C3组均升高,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组c-Jun磷酸化水平、NICD蛋白表达以及Notch1和Jagged1 mRNA表达均明显升高(P<0.01或P<0.05),H3组ERK磷酸化水平显著升高(P<0.01),与QC组相比,Q3组和C3组c-Jun磷酸化水平以及Notch1和Jagged1 mRNA表达明显升高(P<0.01或P<0.05),H3组ERK磷酸化水平显著升高(p<0.01),与HC组相比,H3组和C3组ERK磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平以及Notch1和Jagged1 mRNA表达明显升高(P<0.01或P<0.05),；单体组间比较,与Q3组相比,H3组和C3组ERK磷酸化水平、c-Jun磷酸化水平以及Notch1和Jagged mRNA均明显升高,差异有统计学意义(p<0.01或P<0.05)。五、DRGn/SCs体外共培养可建立周围神经髓鞘化模型MAP-2免疫荧光染色鉴定,DRGn细胞纯度达97.39±0.09%,MBP免疫荧光染色显示DRGn/SCs共培养体系可在体外形成髓鞘节段。六、高糖不同时间点对DRGn/SCs共培养体系的影响7d时,与CON组相比,50mM HG组MBP和MAG蛋白及mRNA表达显著下降,ERK磷酸化水平显著增强(p<0.01)。七、槲皮素可抑制高糖条件下DRGn/SCs共培养体系中ERK通路介导的髓鞘化损伤1.槲皮素可抑制高糖条件下共培养体系髓鞘节段数目和长度的下降与CON组相比,HG组的髓鞘节段数目和长度显著减少(p<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显著增加(P<0.01)；髓鞘节段数目和长度与槲皮素的剂量呈正相关(P<0.01)。2.槲皮素可抑制高糖条件下共培养体系的髓鞘蛋白和]mRNA表达的下调与CON组相比,HG组MBP和MAG蛋白及nRNA表达均显著降低(p<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显著升高(P<0.01); MBP和MAG蛋白及mRNA表达与槲皮素的剂量均呈正相关(P<0.01)。3.槲皮素可抑制高糖条件下共培养体系ERK通路的激活MAG与p-ERK免疫荧光双染检测结果显示,p-ERK与MAG染色阳性的位置基本重合。与CON组相比,HG组的ERK蛋白磷酸化水平和p-ERK表达显著升高(P<0.01)；与HG组相比,不同剂量槲皮素组与U0126组均显著降低(P<0.01); ERK蛋白磷酸化水平p-ERK表达与槲皮素的剂量负相关(P<0.01)。八、槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下DRGn/SCs共培养体系中ERK通路介导的髓鞘化损伤1.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下共培养体系髓鞘节段数目和长度的下降与HG组相比,各药物干预组髓鞘节段数目和长度均增多,差异显著(p<0.01)；与QHC组相比,QK、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显著减少(p<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3和H3组均明显减少(P<0.01或P<0.05),与QC组相比,Q3组和C3组明显减少(P<0.05或P<0.01),与HC组相比,H3组和C3组均显著减少(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组均明显减少(P<0.05)。2.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下共培养体系的髓鞘蛋白和mRNA表达的下调与HG组相比,各药物干预组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均升高,差异显著(p<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显著降低(p<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和H3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均明显降低(P<0.01或P<0.05),与QC组相比,Q3和C3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均明显降低(P<0.01或P<0.05),与HC组相比,H3组和C3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均显著降低(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3组和C3组MBP和MAG蛋白及mRNA表达均降低,差异有统计学意义(p<0.01或P<0.05),与H3组相比,C3组MBP和MAG mRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.槲皮素、水蛭素和桂皮醛单体及组合可抑制高糖条件下共培养体系ERK通路的激活MAG与p-ERK免疫荧光双染检测结果显示,p-ERK与MAG染色阳性的位置基本重合。与HG组相比,各药物干预组ERK磷酸化水平和p-ERK表达均降低,差异显著(P<0.01)；与QHC组相比,QH、QC、HC组及Q3、H3、C3组均显著升高(p<0.01)。两两组合与单体间比较,与QH组相比,Q3组和C3组p-ERK表达明显增加(p<0.01或P<0.05),H3组ERK磷酸化水平显著升高(P<0.01),与QC组相比,C3组ERK磷酸化水平和p-ERK表达均显著升高(P<0.01),与HC组相比,H3和C3组ERK磷酸化水平显著升高(P<0.01)；单体组间比较,与Q3组相比,H3和C3组ERK磷酸化水平和p-ERK表达显著升高(P<0.01)。[结论]1.高糖通过诱导SCs ERK通路激活,同时活化其下游靶点SCs成髓鞘负性调控因子c-Jun和Notch通路,抑制SCs的增殖和分化,降低CNTF的分泌水平,减少髓鞘相关蛋白P0的蛋白表达以及髓鞘调控基因P0、Krox-20和MAG mRNA表达,从而导致SCs成髓鞘损伤。2..槲皮素、水蛭素、桂皮醛单体单用组、两两配伍组和三种单体复方组能够通过抑制高糖诱导的ERK通路的激活,同时阻断其下游靶点c-Jun和Notch通路的活化,促进SCs的增殖和分化,增加CNTF的分泌水平,上调P0的蛋白表达以及P0、Krox-20和MAG mRNA表达水平,从而有效缓解高糖诱导的SCs成髓鞘的损伤。单体之间比较,槲皮素的作用优于水蛭素和桂皮醛。两两配伍组作用优于组合中配伍的单体单用组。三种单体复方组的作用均优于两两配伍组和单体单用组。3.高糖通过诱导共培养体系中SCs的ERK通路的激活,下调髓鞘相关蛋白MBP和MAG蛋白和mRNA表达,减少共培养体系形成的髓鞘节段数目和长度,从而引起DRGn/SCs共培养体系髓鞘化的损伤。4..槲皮素、水蛭素、桂皮醛单体单用组、两两配伍组和三种单体复方组均能通过抑制高糖条件下共培养体系中SCs的ERK通路的激活,提高MBP和MAG的蛋白和mRNA表达,增加共培养体系形成的髓鞘节段数目和长度,从而有效缓解高糖对共培养体系髓鞘化的损伤。槲皮素的作用优于水蛭素和桂皮醛。两两配伍组作用优于组合中配伍的单体单用组。三种单体复方组的作用均优于两两配伍组和单体单用组。[创新点]本课题分别采用高糖诱导SCs成髓鞘损伤模型和高糖诱导DRGn/SCs共培养体系髓鞘化损伤模型,探讨ERK信号通路在高糖诱导周围神经系统髓鞘损伤中的作用以及槲皮素、桂皮醛、水蛭素及单体组合的干预作用,为DPN髓鞘损伤机制的阐明和筋脉通防治DPN提供理论基础和实验依据,经检索国内外文献未见报道。