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第一部分香烟提取物对小鼠肺上皮细胞intelectin及白介素6、单核细胞趋化因子1表达的影响目的：检测香烟提取物刺激小鼠肺上皮细胞后,intelectin、IL-6和MCP-1的表达,为下一步的研究提供方向。方法：我们选择小鼠肺上皮细胞MLE-12作为研究细胞,首先检测香烟提取物(CSE)对该细胞的毒性以选择合适的刺激浓度和刺激持续时间,随后用定量PCR方法检测不同浓度CSE以及同一浓度不同时间点刺激小鼠肺上皮细胞后,intelectin、IL-6和MCP-1的表达。结果：用浓度>10%的CSE刺激细胞24h后,细胞活性显著降低,而延长刺激时间至72h时,CSE浓度大于2.5%后其活性就有较明显的下降。因此,我们选用5%CSE、10%CSE刺激小鼠肺上皮细胞24h,结果与预期的恰恰相反,定量PCR示Intelectin1 mRNA的含量随着CSE浓度的增加逐渐增加,10%CSE组Intelectin1 mRNA的含量高于正常组,同时,IL-6 mRNA的含量在10%CSE组下降,而Intelectin2和MCP-1 mRNA的含量在三组间差异无显著性。选用2.5%CSE分别刺激细胞8h、24h、72h后发现,2.5%CSE刺激小鼠肺上皮细胞72h后Intelectin2 mRNA含量增加,2.5%CSE刺激24h后MCP-1 mRNA含量下降,而Intelectin1和IL-6 mRNA的表达无改变。结论：Intelectin细胞实验结果表明,CSE刺激小鼠肺上皮细胞后,Intelectin-1和-2表达增加,IL-6和MCP-1的表达下降,CSE对这些因子表达的不同影响可能和香烟烟雾刺激的浓度和时间的不同有关,需要进一步在体内实验以证明其在香烟致肺部炎症中的作用。香烟烟雾刺激后,MLE-12细胞Intelectin的升高和IL-6、MCP-1的下降存在何种关系,也需要更进一步的研究。第二部分Intelectin在小鼠肺上皮细胞白介素6、单核细胞趋化因子1表达中的作用目的：利用RNA干扰和基因过表达技术,探讨intelectin是否参与了CSE下调肺上皮细胞MLE-12中IL-6、MCP-1的表达。方法：构建intelectin1/2干扰质粒PGCsi3.0-shRNA,其瞬时转染小鼠肺上皮细胞MLE-12并用CSE刺激24h后,定量PCR检测intelectin1、intelectin2、IL-6和MCP-1 mRNA的表达；另外采用高表达intelectin1 cDNA的质粒pEF-BOS-ITLN1-cDNA瞬时转染小鼠肺上皮细胞MLE-12后,48h后检测上述基因的表达。结果：成功构建了intelectin1/2干扰质粒,其能够下调CSE刺激MLE-12细胞后的intelectin1的升高,而且,intelectin1/2干扰质粒转染后能够逆转CSE引起的IL-6下降。高表达intelectin1 cDNA的质粒pEF-BOS-ITLN1-cDNA瞬时转染小鼠肺上皮细胞MLE-12后,48h后检测上述基因的表达发现,转染该质粒可以明显升高intelectin1的表达,而IL-6 mRNA却明显下降。结论：综合RNA干扰和intelectin1 cDNA高表达质粒转染小鼠肺上皮细胞MLE-12的结果,intelectin1参与了CSE下调小鼠肺上皮细胞MLE-12上IL-6 mRNA的表达。我们推论,CSE可以上调肺上皮细胞intelectin1的表达,增加的intelectin1可以降低其IL-6的表达,下降的IL-6使肺泡上皮细胞的抗感染能力下降,IL-6引起的抗感染能力下降抵消甚至超过了intelectin1本身引起的抗感染能力的增加,这可能是CSE增加肺部感染的风险的一个原因。这些推论仅仅基于体外细胞实验结果,intelectin到底在香烟烟雾致肺部炎症中发挥着怎样的作用,需要我们进一步在动物体内进行研究。第三部分慢病毒介导的RNA干扰技术抑制烟熏小鼠肺组织Intelectin表达的研究目的：探讨intelectin在香烟烟雾致小鼠肺部炎症中的作用。方法：构建小鼠intelectin1/2 RNA干扰慢病毒载体,进行病毒包装,经鼻滴入小鼠气道以抑制烟熏小鼠肺组织intelectin的表达,随后小鼠暴露于香烟烟雾4周,检测肺泡灌洗液中细胞总数和分类细胞计数、观察肺组织形态学改变、气道周围炎症改变,以及检测肺组织中intelectin和白介素6的表达。结果：小鼠全身暴露于香烟烟雾4周后,其肺部产生了亚急性炎症,气道周围、肺泡炎症细胞浸润增加,肺组织Intelectin mRNA和蛋白水平增加,mRNA水平的增加主要体现在Intelectin2;肺脏的IL-6mRNA表达增加。此外,成功构建了小鼠Intelectin1/2RNA干扰慢病毒载体并包装成功,在气道上皮细胞用溶血磷脂胆碱(LPC)预处理后,慢病毒载体介导的RNA干扰降低了肺脏Intelectin的水平,intelectin的降低并未引起白介素6的表达改变,也并未引起明显的肺泡灌洗液中细胞数目和种类的改变,以及气道周围炎症的改变。结论：香烟烟雾的浓度和刺激持续时间的长短将影响肺脏intelectin和白介素6的表达；用LPC预处理小鼠气道上皮后,慢病毒载体介导的RNA干扰降低了肺脏intelectin的水平,但是并未引起明显的肺泡灌洗液中细胞数目和种类的改变,以及气道周围炎症的改变, IL-6的含量也没有受到影响,这可能是因为IL-6可以由多种细胞产生的结果。