本文是在在本课题组发现莲中富含低聚原花青素,并证实其能有效清除自由基、抗脂质过氧化、调节血脂、保护心脏研究基础上,旨在利用现代医学、分子生物技术和药理实验方法,从抗氧化、病理形态、细胞凋亡、基因调控、改善神经递质系统的代谢等角度,针对我国和世界人口老龄化及老年痴呆患者日益增多的趋势,根据此病发病的β淀粉样蛋白(Aβ)级联学说与自由基学说,以莲中活性因子-原花青素为对象,选用乙醇和东莨菪碱致学习记忆障碍、D-半乳糖致亚急性衰老和快速衰老小鼠SAMP8等四种不同类型的老年性痴呆动物模型以及Aβ1-42诱导海马神经细胞损伤模型,系统研究和探讨了莲原花青素对老年性痴呆的预防和治疗作用及其分子机制,以填补莲原花青素抗老年性痴呆这一研究空白,为预防和治疗老年性痴呆探索新思路,新方法,为寻找新的老年性痴呆天然有效药物及保健品提供实验依据和理论基础,并有利于促进我国莲资源的综合开发和利用。同时也为原花青素-这类自然界中广泛存在的一大类酚类化合物的改善认知功能的作用研究提供科学参考。　　 主要研究结果如下:　　 1.莲房原花青素对学习记忆障碍小鼠的改善作用的研究　　 1.1 LSPC对乙醇致小鼠学习记忆再现障碍的改善作用　　 小鼠连续灌胃22.5 mg/kg bw、45 mg/kg bw和90mg/kg bw LSPC20天,制备40％乙醇所致学习记忆障碍模型小鼠,采用Y迷宫法观察,结果显示三种不同剂量的LSPC对乙醇致学习记忆障碍小鼠均有显著地改善作用,其中90mg/kgbw LSPC组的错误次数低于正常对照组,效果优于阳性对照药物脑复康。而且三种不同剂量均可减少小鼠脑中MDA的含量、提高SOD活性和降低MAO—B活性,并达到极显著水平。说明LSPC对乙醇诱导的小鼠学习记忆障碍有很好的改善作用,其机制可能与抑制乙醇引起的小鼠脑中MAO-B活性的升高,同时减少神经元的氧化损伤有关。　　 1.2 LSPC对东莨菪碱致小鼠学习记忆获得障碍的改善作用　　 小鼠连续灌胃30 mg/kg bw、60 mg/kg bw、90 mg/kg bw和150 mg/kg bwLSPC20天,制备3mg/kg东莨菪碱所致学习记忆障碍模型小鼠,采用Y迷宫法观察,显示四种不同剂量的LSPC对东莨菪碱致学习记忆障碍小鼠均有显著地改善作用。摄入适量的LSPC可减少小鼠脑中MDA和NO的含量、提高SOD活性和降低总NOS、神经型NOS和AchE活性,经统计学分析,均达到显著性水平。说明LSPC对东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆障碍也有很好的改善作用,其机制可能与抑制东莨菪碱引起的小鼠脑中AchE活性的升高,同时减少神经元的氧化损伤有关。此外,LSPC能显著减少衰老小鼠脑中作为炎症因子和与睡眠觉醒有关的NO的含量,提示LSPC还可能通过改善睡眠改善学习记忆功能,这是一个不可忽视的潜在的重要因素,关于这一点尚有待进一步研究。　　 2.莲房原花青素对D-半乳糖致亚急性衰老小鼠学习记忆的改善作用及机制的研究　　 以颈部皮下注射120mg/kg bw D-半乳糖的方式造模,在造模型的同时,给予实验小鼠30、60、90 mg/kg bw LSPC8周,采用Y迷宫和跳台法显示三种不同剂量的LSPC对小鼠学习记忆过程均有显著地改善作用。并能显著降低衰老小鼠血清中β-AP含量,降低衰老小鼠脑组织中MDA和NO含量,降低脑组织中AchE、MAO-B、总NOS、iNOS和nNOS活性,同时提高SOD、GSH-Px的活性。LSPC能抑制神经细胞异常,发生凋亡,减少促凋亡基因P53蛋白的表达。这些结果提示LSPC对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的改善机理有三。其一,提高体内抗氧化酶活性,抑制组织中自由基及其中间有毒产物的产生,抑制细胞的脂质过氧化反应。其二,抑制神经细胞发生凋亡,保护细胞免受损伤。其三,增强与认知功能有关的胆碱能和单胺能系统的功能,提高学习记忆能力。另外,LSPC能显著减少衰老小鼠脑中作为炎症因子和与睡眠觉醒有关的NO的含量,提示LSPC还可能通过改善睡眠改善学习记忆功能,这是值得注意的潜在的另一重要机制,关于这一点尚有待进一步研究。　　 3.莲房原花青素对SAMP8学习记忆的改善作用及机制的研究　　 本章是建立在采用化学损毁模型和D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型已证实LSPC能有效改善受损小鼠认知功能的基础上,采用快速老化痴呆模型小鼠SAMP8研究LSPC抗衰老的作用及其机制。SAMP8是快速老化的SAMP(senescence accelerated—prone mouse,SAMP)系中的一个亚系,可作为自然发病的老化痴呆鼠模型,它们有学习记忆功能呈增龄性加速衰退和老年性痴呆的诸多神经病理特征,显示出早期老化和加速老化的特点,主要表现为学习记忆障碍,脑内β—AP颗粒样结构广泛沉着、皮质萎缩、海马锥体细胞减少等。因此,SAMP8可作为一种比较理想的AD模型,用于对AD具有潜在疗效的药物研究。　　 为此,选用3月龄的SAMP8作为AD实验模型,同龄的SAMR1为正常对照鼠,给予LSPC60、90、120 mg/kg bw3个月,采用Y迷宫观察到SAMP8的学习记忆功能在6月龄时与SAMR1相比严重受损,但是LSPC能明显改善小鼠的学习记忆能力。并能抑制6月龄SAMP8脑组织中β-APP的过度表达和5、6月龄SAMP8血清中β-AP含量,降低6月龄SAMP8脑组织和5、6月龄SAMP8血清中MDA和NO含量,降低6月龄SAMP8脑组织中AchE、MAO—B和nNOS活性,5、6月龄SAMP8血清中总NOS活性,同时提高6月龄SAMP8脑组织和5、6月龄SAMP8血清中GSH含量,增强SOD、GSH-Px和anti-ROS的活性及TAOC,另外LSPC能抑制6月龄SAMP8神经细胞发生凋亡,Bcl-2的表达量上调而Bax表达量下调。这些结果提示LSPC对SAMP8学习记忆能力的改善机理有四,这些机理在体内产生协同作用。其一,提高体内抗氧化酶活性,抑制组织中自由基及其中间有毒产物的产生,抑制细胞的脂质过氧化反应；其二,增强与认知功能有关的胆碱能和单胺能系统的功能,提高学习记忆能力；其三,抑制β-APP和β-AP在体内过度表达和生成及其对神经细胞产生神经毒作用,让神经细胞免受损伤；其四,通过调节与凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,来抑制神经细胞发生凋亡。　　 此外,研究还发现,LSPC是从5月龄开始对SAMP8的衰老表现出明显的抑制作用,到6月龄时显示出统计学上有显著或极显著性差异的结果。而且SAMP8在衰老过程中血清中的抗氧化指标的变化,同脑组织中抗氧化能力下降十分一致,由此我们认为血清中抗氧化指标的变化可以作为衰老的一个主要标志。　　 另外需要提及的是,LSPC能显著减少SAMP8脑中作为炎症因子和与睡眠觉醒有关的NO的含量,其结果与前面完全一致,进一步提示LSPC改善睡眠的作用是其在改善学习记忆功能中的一个不可忽视且十分重要的可能因素,这是值得注意的潜在机制,关于这一点尚待进一步研究和提出更直接的证据。　　 4.莲房原花青素、原花青素B型二聚体与A型二聚体对Aβ1—42诱导海马神经细胞损伤的保护作用　　 采用圆二色谱检测在37℃孵育0d、3d和7d的Aβ25—35二级结构发现,在Aβ25-35中不存在β-折叠结构,三者几乎没有差异,MTT法结果显示孵育7d的Aβ25—35对海马神经细胞也不产生毒性作用,说明β-折叠结构是导致Aβ25—35产生聚集的基础结构,当Aβ中不存在β-折叠结构时是不可能发生聚集的,也就是说β-折叠结构是Aβ对海马神经细胞产生毒性的必要结构。为此,后续的实验都采用更易聚集的Aβ1-42作为建立神经细胞损伤造模的材料。　　 利用体外培养SD大鼠海马神经细胞,建立Aβ1-42所致的神经细胞损伤模型,MTT实验发现5、10μg/mL的LSPC对Aβ1-42导致的海马神经细胞损伤有很好的保护作用,通过FCM和TUNEL进一步发现2.5、5、7.5μg/mL LSPC能抑制Aβ1-42诱导的细胞凋亡,可能与LSPC能减少细胞内氧化应激产生的有害产物MDA,提高GSH含量、GSH-PX抗氧化酶活性,增强TAOC和anti—ROS的能力、抑制NF-kB的活化和促凋亡基因P53的表达以及改变细胞周期分布使细胞周期阻滞在DNA合成前期即G1期有关。虽然通过TUNEL发现相同剂量的A2和B2对Aβ1-42诱导的细胞凋亡有一定的改善效果,但效果不及LSPC,且对NF-kB的表达几乎没有抑制效果。这一结果说明,对于天然药物,并不是单一纯品(即使是抗氧化效果最佳的原花青素B2)的效果就是最好,往往活性组分的协同效应显示了更加显著地作用。　　 研究结果发现,LSPC可以改变细胞周期,抑制细胞凋亡。从FCM检测细胞周期的结果可见,5.0μg/mL LSPC能减少(约5个百分点)细胞在G1期的分布,同时也能最佳效果地保护Aβ1-42诱导的细胞凋亡。　　 综上所述,LSPC不仅对乙醇和东莨菪碱致学习记忆障碍、D-半乳糖致亚急性衰老和快速衰老小鼠SAMP8的学习记忆损伤都有很好的改善作用,而且在体外对Aβ1-42诱导海马神经细胞损伤也有很好的保护效果。结果提示,LSPC是一个十分有发展前景的预防和治疗Alzheimer疾病的天然药物,其作用机制不仅是通过显著的抗氧化和抑制自由基的产生,而且还通过加强与认知功能有关的神经递质系统的功能而提高学习记忆能力、抑制β—APP和β-AP在体内过度表达和生成、抑制凋亡基因的表达和改变细胞周期分布等多靶点的参与达到抗老年痴呆的效果。同时也用现代医学证实了我国古代医学书所记载的莲房具有延年、养心安神的作用。