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肉鸡坏死性肠炎(Necrotic enteritis,NE)是鸡养殖场最为常见的一种疾病,通常继发于球虫病,导致肉鸡的增重率下降,死亡率上升,给家禽生产造成直接和间接的经济损失。NE主要是由A型产气荚膜梭菌分泌外毒素引起鸡小肠黏膜坏死为主要特征的一种急性细菌性疾病。本实验利用新型延迟致弱、延迟表达的减毒沙门菌载体(recombinant attenuated Salmonella vector,RASV),构建了表达α毒素C末端(PlcC)和GST标签融合的NetB(gstNetB)的重组沙门菌,体外实验验证了目的抗原的表达及反应原性,并进一步通过体内实验评价其抗肉鸡坏死性肠炎的效果。具体研究内容及结果如下:⑴沙门菌χ9959(pYA3681-PlcC)和χ9959(pYA3681-gstNetB)的制备及反应原性分析本实验利用沙门菌穿梭载体pYA3681构建重组质粒pYA3681-PlcC和pYA3681-gstNetB,电转入大肠杆菌χ6212感受态,经双酶切验证和质粒测序后,再电转入终末宿主菌χ9959。经IPTG诱导后进行SDS-PAGE实验和免疫印迹实验(Western Blotting),证明了目的蛋白获得表达。其中PlcC重组蛋白相对分子质量为18kD左右,gstNetB重组蛋白相对分子质65kD左右。⑵重组沙门菌抗禽坏死性肠炎免疫保护效果的评价本实验研究了重组沙门菌对肉鸡抗坏死性肠炎的保护效果,动物实验分以下五组:PBS组、空载体pYA3681组、pYA3681-PlcC组、pYA3681-gstNetB组以及pYA3681-PlcC+pYA3681-gstNetB混合免疫组。以一日龄雏鸡为实验动物,每周口服免疫一次沙门菌,连续免疫三周,免疫剂量为109CFU/200μl/只。第三次免疫后七天,每组宰杀4只实验动物,取脾脏分离淋巴细胞,流式细胞术检测脾脏中CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞的分化情况,同时翅下取血分离血清,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清IgG及肠道灌洗液中SIgA抗体效价。第28天~第32天进行攻毒实验,每天早晚各一次,以口服饲喂方式进行连续攻毒,攻毒剂量为109CFU/1ml/只,第33天处死所有实验动物,取小肠,进行肠道病变积分计数,并计算各组体重变化率。结果表明,与PBS组、空载体组相比,混合免疫组的雏鸡血清中PlcC、NetB特异性IgG抗体及肠道灌洗液中特异性SIgA抗体水平显著增加;流式结果表明,pYA3681-PlcC组、p YA3681-gstNetB组以及pYA3681-PlcC+pYA3681-gstNetB混合免疫组与PBS组、空载体组相比,CD3+CD4+T细胞含量都显著增加,而各组间CD3+CD8+T细胞含量无显著差异,表明重组菌能诱导CD3+CD4+T细胞增殖;雏鸡体重增重率、肠道病变积分表明重组菌χ9959(pYA3681-PlcC)和χ9959(pYA3681-gstNetB)对肉鸡坏死性肠炎起到了一定的免疫保护作用,其中混合免疫组的效果更好。综合分析,多种抗原同时进行免疫得到更好的效果,可以为进一步研制新型禽坏死性肠炎疫苗奠定基础。