铁死亡是一类铁依赖的脂质过氧化过程。铁死亡在血液病、神经疾病、呼吸系统疾病、心血管系统疾病、生殖系统疾病及肿瘤中的作用均有报道,而铁死亡在泌尿系统疾病的相关报道主要集中于肾衰竭及肾脏肿瘤方面。而铁死亡是否在草酸钙（CaOx）结石的形成中有重要作用,目前尚未见报道。本研究以CaOx晶体介导的肾小管上皮细胞损伤为研究对象,通过蛋白组学技术挖掘出CaOx晶体细胞损伤模型中铁死亡相关蛋白的显著差异性表达,然后在体内和体外实验中验证铁死亡在肾结石形成过程中的影响。通过对肾小管上皮细胞（HK-2细胞）进行不同浓度CaOx晶体进行建模。检测造模后的细胞活力、Fe2+水平、脂质过氧化水平和铁死亡相关蛋白质的差异表达改变,我们发现,与对照组相比,造模组的铁死亡正向调控蛋白TP53（p53）、长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）、转铁蛋白（TF）和转铁蛋白受体（TRC;TFRC）的相对表达量显著增加,而铁死亡负向调控蛋白胱氨酸/谷氨酸转运体轻链亚基（SLC7A11;XCT）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的相对表达量显著降低。Fe2+和脂质过氧化水平逐渐升高,细胞活力明显下降。从以上结果可以看出,CaOx诱导铁死亡激活和细胞损伤的程度依赖于CaOx浓度。为了进一步研究铁死亡与肾小管上皮细胞损伤之间的关系,在体内和体外实验中,采用铁死亡激动剂erastin和铁死亡抑制剂ferrostatin-1在相同CaOx浓度下调节铁死亡的激活水平,进一步观察CaOx介导的肾小管上皮细胞和肾组织的铁死亡水平和细胞组织损伤程度之间的关系。最后,我们发现通过调控铁死亡的激活水平,肾小管上皮细胞及肾组织损伤随着铁死亡水平的升高而明显增加,反之亦然。综上所述,目前结果表明铁死亡是参与CaOx晶体诱导的肾小管上皮细胞及肾组织损伤的重要一环。这一发现具有深远的意义,有助于进一步研究铁死亡与草酸钙肾结石之间的关系。第一部分草酸钙晶体介导的肾小管上皮细胞损伤模型中的4D LFQ定量蛋白质组学研究目的:通过4D LFQ定量蛋白质组学技术检测挖掘与草酸钙肾结石相关的关键致病分子及分子信号通路。方法:首先,使用肾小管上皮细胞（HK-2细胞）分别建立梯度浓度（1m M、2m M）的CaOx细胞损伤及对照模型,待造模完成后对各组细胞进行裂解、酶解后对后续肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用Nano Elute超高效液相系统进行分离。肽段经由超高效液相系统分离后被注入Capillary离子源中进行电离然后经tims-TOF Pro质谱仪进行分析。后续质谱数据使用Maxquant 1.6.15.0进行检索。经由以上分析检索后对相关数据进行生物信息学分析,首先对以上所得数据进行蛋白注释,后续对蛋白注释数据进行蛋白质功能富集、蛋白功能富集聚类分析及蛋白互作网络分析,通过以上分析进一步了解各实验组间差异蛋白的生物学进程、细胞组成、分子功能、亚细胞定位及信号通路富集等信息,并综合以上数据进行汇总分析。结果:通过质谱分析我们一共鉴定到5366个蛋白,其中4690个为可定量蛋白。我们取p-value＜0.05时,以差异表达量变化超过1.5-foldchange作为显著上调的变化阈值,小于1/1.5-foldchange作为显著下调的变化阈值。发现1m M组vs对照组,其中88个蛋白差异表达显著上调,32个蛋白差异表达显著下调;2m M组vs对照组,其中133个蛋白差异表达显著上调,129个蛋白差异表达显著下调。将以上鉴定出的显著差异表达蛋白经生物信息学分析后,发现1m M组vs对照组,其中铁死亡正向调控蛋白转铁蛋白受体（TFRC）表达显著增高;2m M组vs对照组,其中铁死亡正向调控蛋白转铁蛋白受体（TFRC）差异表达显著增高,铁死亡负向调控蛋白铁蛋白重链（FTH1）差异表达显著降低。结论:经4D蛋白组数据挖掘发现CaOx晶体损伤细胞模型中,铁死亡相关蛋白TFRC及FTH1均有显著差异表达,提示铁死亡过程可能参与CaOx晶体损伤过程,为肾结石研究提供了崭新的研究方向。第二部分铁死亡在草酸钙介导的肾小管上皮细胞损伤模型中的效应及机制研究目的:在体外细胞水平验证铁死亡参与CaOx晶体损伤过程,并探究铁死亡在晶体损伤过程中的相关机制。方法:首先,使用肾小管上皮细胞（HK-2细胞）建立梯度浓度（1m M、2m M、4m M）的CaOx晶体损伤及对照模型。待造模完成后检测细胞活力、脂质过氧化水平、铁死亡相关蛋白质的差异表达,观察不同浓度CaOx下铁死亡激活水平以确定后续实验CaOx晶体浓度,选取合适CaOx晶体浓度（2m M）进行后续细胞实验。为进一步研究铁死亡与晶体介导的肾小管上皮细胞损伤之间的关系,采用铁死亡激动剂erastin和铁死亡抑制剂ferrostatin-1在相同CaOx浓度下调节铁死亡的激活水平,进一步观察CaOx介导的肾小管上皮细胞损伤程度和铁死亡激活水平之间的关系。通过检测各组细胞Fe2+水平、脂质过氧化水平、ROS水平、线粒体膜电位水平、抗氧化能力及铁死亡相关蛋白差异表达改变。我们接着构建了铁死亡关键基因GPX4的过表达和空载体的稳定转染的HK-2细胞株,并建立晶体细胞损伤和对照模型,检测铁死亡相关蛋白、细胞活力及脂质过氧化水平等改变。结果:观察不同浓度（1m M、2m M、4m M）的CaOx晶体损伤模型中结果发现,随CaOx晶体浓度的不断提高,铁死亡正向调控蛋白TP53（p53）、长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）,转铁蛋白（TF）和转铁蛋白受体（TRC;TFRC）的相对表达量逐渐增加,而相对的铁死亡负向调控蛋白胱氨酸/谷氨酸转运体轻链亚基(SLC7A11;XCT和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的相对表达量逐渐降低。且细胞损伤程度、脂质过氧化水平随晶体浓度的提高而显著提高,而细胞活力、细胞抗氧化能力显著降低通过铁死亡激动剂、铁死亡抑制剂及基因过表达技术对晶体损伤模型中的铁死亡水平进行人为调控后发现铁死亡水平上调组中,铁死亡正向调控蛋白长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）,转铁蛋白（TF）和转铁蛋白受体（TRC;TFRC）的相对表达量逐渐增加,而相对的铁死亡负向调控蛋白胱氨酸/谷氨酸转运体轻链亚基（SLC7A11;XCT）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的相对表达量逐渐降低。且铁死亡水平上调组中脂质过氧化水平显著提高,而细胞活力、细胞抗氧化能力显著降低,反之亦然。结论:在细胞水平,通过蛋白免疫印迹技术,验证前期4D蛋白组学数据,证实晶体细胞损伤过程中有铁死亡的参与。且HK-2细胞晶体损伤程度随着铁死亡水平的升高而明显增加,反之亦然。第三部分铁死亡在草酸钙大鼠损伤模型中的调控作用及其机制研究目的:在大鼠模型水平验证铁死亡参与CaOx肾结石形成过程,并探究铁死亡在CaOx肾结石形成过程中的相关机制。方法:我们以SD大鼠为研究对象,建立CaOx肾结石模型、CaOx肾结石铁死亡上调模型、CaOx肾结石铁死亡抑制模型及对照组模型。通过Von Kossa钙盐染色观察肾内晶体沉积情况及计算肾小管损伤分数,通过蛋白免疫印迹检测组织内铁死亡相关蛋白的差异表达情况,通过ELISA检测肾损伤标志物NAGL及KIM-1的表达趋势。再使用TUNEL染色检测各组组织细胞的细胞损伤程度。结果:通过铁死亡激动剂、抑制剂对大鼠肾结石模型铁死亡水平调控后发现,与对照组相比,CaOx肾结石铁死亡抑制组、CaOx肾结石组、CaOx肾结石铁死亡上调组中,铁死亡正向调控蛋白长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）,转铁蛋白（TF）和转铁蛋白受体（TRC;TFRC）的相对表达量逐渐增加,而相对的铁死亡负向调控蛋白胱氨酸/谷氨酸转运体轻链亚基（SLC7A11;XCT）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的相对表达量逐渐降低。同时,按上述分组顺序对比,肾内晶体沉积程度及肾小管损伤分数显著增加,且肾组织内脂质过氧化水平及损伤程度明显增高。结论:在大鼠动物模型水平,通过蛋白免疫印迹技术,验证前期4D蛋白组学数据,证实CaOx肾结石形成过程中有铁死亡的参与。且CaOx肾结石模型大鼠的肾组织损伤程度随着铁死亡水平的升高而明显增加,反之亦然。