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研究背景与目的:全身麻醉的开展距今已有160多年的历史,关于全麻机制的解释争论较多,近年来神经科学家认为:作用在大脑不同脑区、核团的全麻药物,通过特定的作用靶点调节神经递质水平,形成神经网络相互作用,使机体在麻醉-觉醒状态间进行转换。2016年PNAS杂志报道:在异氟醚麻醉下,利用光遗传技术激活小鼠中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)的多巴胺能神经元能够使其立即觉醒,VTA核团多巴胺能神经元接收来自腹外侧视前区(ventrolateral proptic nucleus,VLPO),和中缝背核(dorsal raphe nucleu DR)等核团神经纤维的投射,也能够将神经纤维投射到前额皮质区(prefrontal cortex,PFC)和伏隔核(nucleus accumbens,NAc)等核团。那么 VTA核团多巴胺能神经元是如何受到其它神经核团投射调节?又是通过对哪些核团进行调节从而介导麻醉与觉醒之间的转换,目前尚不清楚。基于以上科学问题,本研究将利用free-moving动物模型、脑内核团微注射、神经电生理以及化学遗传学等技术方法,研究在七氟醚麻醉药物诱导以及向觉醒转换过程中,神经环路中VTA核团多巴胺能神经元的作用,探讨VTA-mPFC通路多巴胺能神经元在七氟醚麻醉-觉醒中的调节作用,初步探讨其作用机制。第一部分目的:通过系统性给药、核团微注射和DREADD技术等方法研究VTA核团多巴胺能神经元在七氟醚麻醉-觉醒调控中的作用及机制。方法:实验动物:雄性SD大鼠,体重250～280g。1 系统性证实多巴胺能神经元是否参与七氟醚麻醉-觉醒过程的调控。18只SD大鼠随机分为3组(n=6):CON组、SCH组、APB组。在实验环境适应5d后进行行为学实验,所用药物均稀释到0.5ml。CON组:腹腔注射生理盐水;SCH组:腹腔注射D1受体拮抗剂SCH23390(2mg/kg);APB组:腹腔注射D1受体激动剂Chloro-APB(3mg/kg)。观察药物对大鼠七氟醚麻醉诱导及觉醒时间的影响,麻醉诱导观察指标为翻正反射消失时间,麻醉觉醒观察指标为翻正反射恢复时间。2 药理学方法证实VTA核团对七氟醚麻醉-觉醒的调控作用。60只SD大鼠随机分为5组(n=12):CON组、MK-801 组、SCH组、Bicu(Bicuculline)组、DMSO组。实验前进行VTA核团微注射导管埋置和脑电电极植入,恢复5d后每组随机抽取6只大鼠VTA核团注射相应药物0.3μL。CON组:注射生理盐水;SCH组:注射D1受体拮抗剂SCH23390(5mg/ml);Bicu组:注射GABAA受体拮抗剂Bicuculline(2.5mg/ml);MK-801 组:注射NMDA受体拮抗剂MK-801(0.6mg/ml);DMSO组:作为Bicu组的对照组(DMSO为Bicuculline的有机溶剂)。注药15min后开始麻醉观察药物对七氟醚麻醉诱导时间的影响。每组其余6只大鼠,则于麻醉开始后15min注药,观察药物对麻醉觉醒时间的影响。3 采用DREADD技术证实特异性激活VTA核团多巴胺能神经元对七氟醚麻醉-觉醒的影响。12只大鼠随机分为2组(n=6):hM3Dq组和CON组。hM3Dq组:VTA核团注射含hM3Dq的重组腺相关病毒(rAAV-DIO-hM3Dq-mCherry);CON组:VTA核团注射不带有hM3Dq但其它病毒元件与实验组一致的“空病毒”(rAAV-DIO-mCherry)作为对照。恢复28d后,两组动物均给予腹腔注射CNO,观察特异性激活VTA核团多巴胺能神经元后对大鼠麻醉诱导与觉醒时间的影响。结果:1 大鼠腹腔注射D1受体拮抗剂SCH23390后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间明显缩短(P<0.01),觉醒时间明显延长(P<0.01);腹腔注射D1受体激动剂Chloro-APB后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间明显延长(P<0.01),觉醒时间明显缩短(P<0.05)。2 大鼠VTA核团给予NMDA受体拮抗剂MK-801后与CON组比麻醉诱导时间明显缩短(P<0.01),觉醒时间明显延长(P<0.01);VTA核团给予D1受体拮抗剂SCH23390后与CON组比麻醉诱导时间明显缩短(P<0.01),觉醒时间明显延长(P<0.01);VTA核团给予DMSO后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间及觉醒时间无明显差异(P>0.05);VTA核团给予GABAA受体拮抗剂Bicuculline与DMSO组比麻醉诱导时间明显延长(P<0.05),觉醒时间明显缩短(P<0.05)。3 大鼠经过核团微注射病毒及腹腔注射CNO,特异性激活VTA核团多巴胺能神经元后,hM3Dq组与CON组相比七氟醚麻醉诱导时间延长(P<0.05),觉醒时间显著缩短(P<0.01)。第二部分目的:通过核团微注射和DREADD技术研究VTA-mPFC通路在七氟醚麻醉-觉醒调控中的作用及机制。方法:实验动物:雄性SD大鼠,体重250～280g。1 药理学方法证实mPFC区多巴胺能神经元对七氟醚麻醉-觉醒的调控作用。36只大鼠随机分为3组(n=12):CON组、SCH组、APB组。实验前进行微注射导管埋置,恢复5d后每组随机抽取6只大鼠,mPFC区微注射药物0.5μL,CON组:注射生理盐水;SCH组:注射D1受体拮抗剂SCH23390(5mg/ml);APB组:注射D1受体激动剂Chloro-APB(6mg/ml)。注药15min后开始麻醉,观察药物对七氟醚麻醉诱导时间的影响。每组其余6只大鼠,则于麻醉开始后15min注药,观察药物对麻醉觉醒时间的影响。2 药理学方法证实VTA-mPFC通路对七氟醚麻醉-觉醒的调节作用。48只大鼠随机分4组(n=12):CON组、VTA-Bicu(Bicuculline)组、mPFC-SCH组、Bicu/SCH组。实验前进行微注射导管埋置,恢复5d后每组随机抽取6只大鼠VTA核团与mPFC区注射相应药物,药物浓度分别为Bicuculline(2.5mg/ml)、SCH23390(5mg/ml)。CON组:VTA核团注射Bicuculline的有机溶剂DMSO 0.3μL,mPFC区注射0.5μL生理盐水;VTA-Bicu组:VTA核团注射GABAA受体拮抗剂Bicuculline 0.3μL,mPFC区注射生理盐水0.5μL;mPFC-SCH组:VTA核团注射DMSO 0.3μL,mPFC区注射D1受体拮抗剂 SCH23390 0.5μL;Bicu/SCH组:VTA核团注射Bicuculline 0.3μL,mPFC区注射SCH23390 0.5μL。注药15min后开始麻醉,观察各种药物对七氟醚麻醉诱导时间的影响。每组其余6只大鼠,则于麻醉开始后15min注药,观察药物对麻醉觉醒时间的影响。3 DREADD技术证实VTA-mPFC通路多巴胺能神经元对七氟醚麻醉-觉醒的主要作用。12只大鼠随机分为2组(n=6):hM3Dq组和CON组。hM3Dq组:VTA核团注射含hM3Dq的重组腺相关病毒(rAAV-DIO-hM3Dq-mCherry);CON组:VTA核团注射不带有hM3Dq但其它病毒元件与实验组一致的“空病毒”(rAAV-DIO-mCherry)作为对照组。恢复28d后,两组动物均在mPFC区注射CNO,观察VTA-mPFC通路多巴胺能神经元激活后对大鼠的麻醉诱导与觉醒时间的影响。结果:1 nPFC区注射D1受体拮抗剂SCH23390后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间显著缩短(P<0.01),麻醉觉醒时间显著延长(P<0.01);mPFC区注射D1受体激动剂Chloro-APB后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间显著延长(P<0.01),觉醒时间显著缩短(P<0.01)。2 VTA核团注射Bicuculline后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间延长,麻醉觉醒时间缩短(P<0.01);mPFC区注射SCH23390后与CON组比七氟醚麻醉诱导时间缩短,麻醉觉醒时间延长(P<0.01);而VTA核团注射Bicuculline同时mPFC区注射SCH23390与CON组比差异无统计学意义(P>0.05)。3 hM3Dq组与CON相比,特异性激活VTA-mPFC通路多巴胺能神经元后,七氟醚麻醉诱导时间显著延长(P<0.01),麻醉觉醒时间显著缩短(P<0.01)。结论:本研究证实了VTA核团多巴胺能神经元及其受体活性变化可以对七氟醚麻醉-觉醒产生影响,这些结果提示VTA核团多巴胺能神经元在全麻作用机制的神经网路中发挥重要作用,并且VTA-mPFC通路多巴胺能神经元在麻醉-觉醒的调节中发挥重要作用。