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[目的]构建日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)标准品质粒,通过该标准品质粒检测体系分析索非布韦体外抗JEV病毒活性。[方法]1、利用BHK-21细胞对JEV进行连续盲传培养,通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找并下载JEV全基因序列;BioEdit软件对下载序列进行比对,选取相对保守区域设计特异性引物,通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增获得目的片段。2、1%琼脂糖凝胶对扩增的目的条带进行电泳,目的条带在凝胶成像仪紫外灯下切取,然后通过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收,回收产物克隆连接到pMD-19T载体上,接着转化到DH5α感受态细胞,最后涂布于含100ug/ml氨苄青霉素(Ampicillin,AMP)的LB固态平板,37℃培养箱中过夜培养;挑取LB固态平板上的单个菌,于含AMP的LB液体培养基中进行单克隆培养,提取菌液中的质粒进行双酶切(Sall,Bamhl)鉴定。3、构建的日本乙型脑炎病毒标准品质粒通过无核酸酶的水10倍梯度稀释并记为10-1、10-2、10-3、1 0-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9,每个梯度浓度设置 3 个平行复孔,同时添加日本乙型脑炎病毒原液及10倍梯度稀释病毒液(病毒原液,10-1,10-2,10-3,10-4),设置ddH20空白对照组,利用设计好的特异性引物通过实时荧光定量 PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)SYBR 法检测标准品质粒的稳定性,特异性和灵敏性。4、利用CCK8试剂检测不同浓度的索非布韦(500μM,100μM,20μM,4μM,0.8μM,0.16μM,0.032μM,0.0064μM)对人肝癌细胞(Human hepatoma cell line,Huh-7)的增殖活性,同时设置空白对照组。5、Huh-7细胞上进行药物对JEV的直接杀伤作用,吸附阻断,细胞内增殖抑制以及复制的影响实验;不同途径的抗病毒效果通过RT-qPCR进行相对定量分析。[结果]1、JEV在BHK-21细胞上连续多次培养后,获得病毒培养上清液;根据NCBI数据库下载的JEV序列比对,选取了相对保守的prM结构蛋白区域,利用JEV下载序列(GenBank:MH258853),设计特异性引物扩增得到prM区域的目的片段,经测序鉴定为正确的441个碱基对(base pair,bp)。2、目的片段经1%琼脂糖凝胶电泳回收成功克隆连接到pMD-19T载体并进行单克隆培养,提取菌液质粒经酶切鉴定正确。3、10倍梯度稀释的标准品质粒,经RT-qPCR结果表明,复孔之间数值差异小(<0.5),熔解曲线特异性好,峰值单一;同时以得到的标准品质粒Ct值作为X轴,标准品质粒拷贝数log10作为Y轴得到JEV标准品质粒的标准曲线方程:y=-0.2889x+11.516,R2=0.993。此外,计算得到病毒原液,10-1,10-2,10-3,10-4浓度的病毒拷贝数分别为1184130.27、120912.86、10736.84、1053.45、121.25copies/ul。构建的标准品质粒稳定性和特异性良好,且灵敏度高。4、索非布韦 500μM,100μM,20μM,4μM,0.8μM,0.16μM,0.032μM,0.0064μM与对照组相比,索非布韦对Huh-7细胞活性无统计学差异(P>0.05)。5、索非布韦对JEV的直接杀伤实验表明,不同浓度的索非布韦与对照组相比,有统计学意义(P<0.05),说明索非布韦溶液对JEV有一定程度的直接杀伤效果;但不同浓度索非布韦间无差异(P>0.05)。索非布韦对JEV的吸附阻断实验表明,不同浓度的索非布韦与对照组相比,有显著统计学差异(P≤0.01),说明索非布韦溶液对JEV的吸附具有阻碍作用。索非布韦500μM组较索非布韦50μM组间相比,无统计学意义(P>0.05);其它药物浓度间对JEV的吸附阻断效果均有显著性差异(P≤0.01)。索非布韦对JEV的细胞内增殖抑制实验表明,不同浓度的索非布韦与对照组相比,有显著统计学差异(P≤0.01),说明索非布韦溶液对JEV的细胞内增殖具有抑制效果。索非布韦500μM组较索非布韦50μM组间相比,无统计学意义(P>0.05);其它药物浓度间对JEV的细胞内增殖抑制效果均有显著性差异(P≤0.01)。索非布韦对JEV的复制影响实验表明,索非布韦500μM,50μM,5μM,0.5μM组以及利巴韦林(10μg/ml)组与病毒对照组相比,有显著统计学差异(P≤0.01),说明索非布韦溶液500μM,50μM,5μM,0.5μM和利巴韦林(10μg/ml)对JEV的复制具有抑制效果;索非布韦500μM组与50μM、利巴韦林组相比,无统计学意义(P>0.05)。索非布韦50μM组与5μM、利巴韦林组相比,无统计学意义(P>0.05)。索非布韦5μM组与500μM、0.5μM、利巴韦林组相比,有统计学意义(P<0.05)。其它浓度的索非布韦药物间对JEV的复制抑制效果均有显著性差异(P≤0.01)。[结论]基于JEV prM结构蛋白区域构建的标准品质粒稳定性和特异性好,灵敏度高,适用于对JEV进行病毒拷贝数的定量检测。索非布韦对JEV具有一定程度的直接杀伤效果;对于病毒的吸附阻断,复制抑制以及细胞内增殖抑制效果显著。