背景：蝎毒素是蝎毒中主要的活性多肽，近年来随着其在多种离子通道(Na<'+>、K<'+>、Cl<'->、Ca<'2+>等)方面的生物学功能被认知，已成为科学工作者研究的热点。离子通道在人体细胞的癌变过程中发挥关键的调控作用，是许多药物作用的重要靶点。以往在对东亚钳蝎蝎毒抗肿瘤机制的研究中，观察到蝎毒抗癌多肽可引起胃粘液腺癌MGC-803、人乳腺髓样癌BCalp-37、肺癌A549等肿瘤细胞内钙离子浓度升高，推测抗癌多肽可能通过升高肿瘤细胞内[Ca<'2+>]I启动肿瘤细胞凋亡机制而诱导肿瘤细胞凋亡。目前国外已从不同种属的蝎毒中得到约十个特异作用于Ca<'2+>通道的毒素，以来源于Pandinus imperator的IpTxA，矛口来自Scorpion maurus palmatus的Maurocalcine(Mca)为代表。它们多是Ca<'2+>通道软诺丁受体(RyR)的激动剂，以剂量依赖的方式诱导Ca<'2+>由肌浆网钙库中释放。近年我国在东亚钳蝎的研究方面也取得了一些成就，但多集中在钠、钾、氯通道毒素，对钙通道毒素的研究极少。由于蝎毒中含有的多肽成分多达几十种，各成分分子质量比较接近，从天然蝎毒中制备和纯化纯蝎毒多肽蛋白比较困难，更难达到规模化生产。随着生物技术的发展，克隆并表达蝎毒素基因，可以获得大量高纯度的重组蝎毒素蛋白，为更深入的研究和应用提供基础。 目的：克隆东亚钳蝎钙通道样毒素(BmCa)基因，并构建原核表达质粒，获得基因工程菌株，在大肠杆菌中重组表达有活性的重组蛋白。 方法： 一、东亚钳蝎Ca<'2+>通道样毒素cDNA的克隆及其表达载体的构建 1、Trizole法提取东亚钳蝎尾部毒腺总RNA，以总RNA为模板，采用RT-PCR法扩增目的基因，扩增产物直接与克隆载体pGEM-T进行连接，连接子转化大肠杆菌感受态TOP10细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选初步鉴定为阳性的菌落，进行质粒的抽提，酶切鉴定送测序。 2、将测序正确的pGEM-T-BmCa．质粒用BamHI、NheI双酶切，纯化后连结于用同样两种酶切的PET-GsT表达载体中，重组质粒转化大肠杆菌感受态TOP10细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选出阳性克隆，抽提质粒酶切鉴定并测序。 二、东亚钳蝎Ca<'2+>通道样毒素的表达与蛋白纯化 1、将正确的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21，37℃培养至A 600=0.5-1.0、用终浓度为1mmol/L IPTG、30℃诱导表达，SDS-PAGE电泳检测表达蛋白。优化表达条件，选用高效表达菌株大量表达。 2、将诱导表达的大肠杆菌冰浴超声破碎，离心沉淀用1％Triton X-100洗涤后，采用8M尿素(含10mMDTT)溶解GST-BmCa包涵体，利用融合蛋白上的6His能与多种金属鳌合物结合的特性，采用Ni-SuperChelating Resin柱亲和层析纯化融合蛋白，采用尿素梯度透析法复性融合蛋白。 三、重组Ca<'2+>通道样毒素对骨骼肌细胞内游离钙浓度的影响 采用组织块法制备新生大鼠骨骼肌细胞，于含10％小牛血清的DMEM中，5％CO2，37℃孵箱培养。将单层培养的大鼠骨骼肌细胞用PBS液漂洗3次，加入含有Fluo-3的DMEM液，37℃负载30 min，用不含荧光探针的培养液洗涤2～3次，上机检测。激发波长488nm激光，选取固定视野摄影记录荧光强度，加2×10<'-6>mol/L重组蛋白，以6s间隔连续记录8min，统计荧光强度变化。 结论：成功克隆BmCa基因，并构建原核表达体系PET-GST-BmCa重组质粒，获得BmCa的基因工程菌株；通过对重组质粒的体外诱导，并对目的蛋白进行了有效的分离、纯化，得到较高纯度的融合蛋白；经细胞体外实验的初步观察表明融合蛋白具有一定活性。在大肠杆菌中成功表达了有活性的东亚钳蝎钙通道样毒素蛋白，为其功能研究奠定了良好的基础。