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目的：
从某医院患者无菌体液中感染细菌的病例调查出发，分析多重耐药的革兰阴性菌感染的危险因素。并在体外将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)暴露于一定条件的头孢他啶或美罗培南，对抗菌药物暴露后耐药的菌株和临床上分离的多重耐药PA(multi-drug resistant PA, MDR-PA)的具体耐药机制进行比较研究。此外，通过体外联合药敏试验比较以粘菌素为基础的联合方案对两组耐药菌株(即抗菌药物暴露后耐药的菌株和临床上分离的耐药菌株)的抑菌效果，以期为临床上治疗多重耐药的PA感染的方案优化提供依据。
一、无菌体液多重耐药的革兰阴性菌感染的危险因素分析
方法：
1.研究设计：对山西省某三甲医院2019年1月1日-2019年6月30日间无菌体液中分离出革兰阴性细菌的所有病人进行回顾性分析。纳入标准是所有在院患者至少一次无菌体液分离出革兰阴性细菌。排除标准是：1)临床资料信息不全或无菌体液检出的细菌无药敏结果判断标准；2)按照保留同一患者相同细菌第一株的原则剔除重复菌株。根据所有病例无菌体液中检出细菌的信息和微生物敏感性检测结果，将所纳入的病例分为两组-多重耐药菌感染组和非多重耐药菌感染组来进行分析。
2.数据收集：查阅纳入患者的病例并收集人口学信息包括性别、年龄等，临床资料包括合并症，既往史，此次住院信息等，以及微生物检查资料包括无菌体液分离出的细菌，药敏结果等。
3.统计分析：连续变量之间的比较分析采用ttest或者nonparametricMann-Whitneytest。分类变量之间的比较分析采用Chi-squaredtest或者Fisherexacttest。对纳入的所有变量进行单因素回归分析，并将单因素分析中P＜0.05的变量纳入多因素Logistic回归分析中来确定多重耐药的革兰阴性菌感染的独立危险因素。P＜0.05认为有统计学差异。
结果：
1.研究设计：最终一共107个病例纳入该研究，其中多重耐药菌感染的病例有51例，非多重耐药菌感染的病例有56例。一共119株革兰阴性菌株纳入该研究，其中多重耐药菌55株，非多重耐药菌64株。
2.标本类型和细菌分布：119株非重复的革兰阴性菌株大多(75%)来自血标本。排名前3位的细菌分别是大肠埃希菌(48%)，肺炎克雷伯菌(13%)和铜绿假单胞菌(10%)。
3.危险因素分析：两组患者的单因素分析表明，有心脏疾病和抗菌药物暴露史的患者无菌体液中更容易分离出多重耐药菌(P＜0.05)。多因素Logistic回归分析表明抗菌药物暴露史是多重耐药的革兰阴性菌感染的独立危险因素(OR,2.404;95%CI,1.058-5.050;P=0.031)。
结论：
抗菌药物暴露史是多重耐药的革兰阴性菌感染的独立危险因素。
二、抗菌药物暴露浓度和暴露时间对PA耐药性的影响
方法：
1.抗菌药物对PA的原始MIC测定：采用琼脂倍比稀释法测定MIC。
2.体外PA暴露于抗菌药物的方法建立：配置含4×MIC，2×MIC，1×MIC，0.5×MIC，0.25×MIC头孢他啶或美罗培南的含药培养基，将菌株分别暴露于相应的含药培养基上培养24h。然后转移至新的含相同浓度药物的培养基上继续培养24h，重复此培养直到第9天。保存培养第1,3,5,7,9天的菌株。
3.保存的体外暴露于抗菌药物后的菌株MIC测定：琼脂倍比稀释法。
4.统计分析：采用重复测量方差分析来研究不同浓度和不同时间的抗菌药物暴露对PA耐药性的影响。主效应分析采用LSD-t检验。计数资料之间的比较采用Chi-squaredtest或者Fisherexacttest。
结果：
1.菌株选择：从微生物实验室检出的全敏感的铜绿假单胞菌中随机选取3株做为实验菌株，分别编号为PA1，PA2，PA3，并定义为原始菌株。
2.PA暴露于抗菌药物后的MIC值：暴露于头孢他啶或美罗培南后，菌株大多变得不敏感。PA连续暴露于4×MIC浓度的美罗培南5天后，PA不仅对美罗培南耐药，也对环丙沙星，头孢他啶耐药，即变为多重耐药菌。
3.暴露浓度和暴露时间对MIC值的影响：暴露于不同浓度的头孢他啶或美罗培南以后，各浓度下MIC值相似(P＞0.05)，即暴露浓度对MIC值影响不大。PA暴露于头孢他啶或美罗培南后，MIC值随着暴露时间的延长整体上看呈现增加的趋势,且MIC值随着时间的延长变化有统计学差异(P＜0.001)。PA暴露于头孢他啶后MIC值在第三天达到最大，之后随着暴露时间的延长MIC值均比第3天降低，但都高于原始的MIC值。PA暴露于美罗培南后，暴露3天的MIC值比暴露1天高，暴露时间为5天，7天和9天的MIC值比暴露3天的高(P＜0.05)；而暴露5天，7天，9天这3个时间点之间两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
4.暴露浓度和暴露时间对不敏感率的影响：暴露于不同浓度的头孢他啶或美罗培南后菌株的不敏感率相似(P＞0.05)。暴露于头孢他啶1天后菌株对头孢他啶不敏感率迅速上升到80%，之后暴露3、5、7、9天后菌株对头孢他啶的不敏感率相似(P=1.000)。暴露于美罗培南1天后，菌株对美罗培南的不敏感率上升到54.5%，暴露3天及以后不敏感率均为100%。
结论：
1.PA暴露于头孢他啶或美罗培南后，不同浓度下MIC值相似；暴露于某一浓度的药物后，MIC值随着暴露时间的延长表现出增加的趋势。
2.PA连续暴露于一定浓度的头孢他啶或美罗培南9天后，菌株的MIC值在前3天增长较快，3天以后MIC值增长缓慢或趋于稳定。
3.在体外长时间连续暴露于一定浓度的美罗培南后PA会变为多重耐药菌。
三、体外诱导和临床上分离的多重耐药铜绿假单胞菌的耐药机制比较
方法：
1.菌株来源：第2部分实验中经抗菌药物暴露以后变为多重耐药的菌株，将该组菌株定义为暴露组。山西省某医院微生物室从临床患者标本中分离的多重耐药铜绿假单胞菌，将该组菌株定义为临床组。
2.对多种药物MIC的测定：采用琼脂倍比稀释法测定对头孢他啶，亚胺培南，氨曲南，哌拉西林/舒巴坦，阿米卡星和粘菌素的MIC值。
3.常见耐药基因的扩增：根据TIANampBacteriaDNAKit的操作步骤提取DNA，然后根据2×SanTaqPCRMix预混液(含蓝染料)的指示步骤建立PCR反应体系扩增耐药基因。扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳。
4.外排泵基因表达量的测定：根据柱式细菌总RNA抽提纯化试剂盒的操作步骤提取RNA，然后根据MightyScript第一链cDNA合成MasterMix试剂盒指示进行反转录，最后根据2×RealtimePCRSupermix(SYBRgreen, with anti-Taq)指示步骤建立荧光定量PCR反应体系测定基因表达量。
5.统计分析：两组菌株外排泵基因表达量的比较采用nonparametricMann-Whitneytest。
结果：
1.菌株选择：第2部分实验中暴露于美罗培南后得到3株多重耐药菌，分别编号为PA3-5,PA3-7,PA3-9。从临床上收集的39株MDR-PA分离株中筛选出了6株与上述3株菌MIC值相近的菌株，分别编号为PA4,PA5,PA6,PA7,PA8,PA9。上述9株菌用于该部分实验。
2.菌株对6种药物的MIC值：这9株菌除对粘菌素敏感外，对其它5种药物都耐药。
3.耐药基因的检测：暴露组菌株携带CTX-M1，TEM，IMP等编码β-内酰胺酶的基因，且oprD基因都缺失。临床组菌株携带SHV、IMP、ant(6’)-I等基因，且oprD基因都存在。
4.外排泵基因的表达量：暴露组菌株mexA基因和mexX基因表达量上调。临床组菌株mexA，mexC，mexE，mexX外排泵基因表达量都上调。暴露组菌株mexA基因表达量比临床组明显上调(P＜0.05)，而临床组菌株的mexC和mexE基因表达量比暴露组明显上调(P＜0.05)。
结论：
1.临床上收集的MDR-PA耐药机制主要是产生SHV、IMP两种β-内酰胺酶和外排泵基因表达量上调。
2.体外长时间暴露于美罗培南后，PA通过多种机制包括产生多种β-内酰胺酶，oprD基因缺失或mexA外排泵基因高表达获得多药耐药性。
四、以粘菌素为基础的联合方案对暴露组和临床组的MDR-PA的抑菌效果比较
方法：
1.菌株选择：采用第3部分实验中的9株菌。
2.联合方案的制定：以粘菌素为基础药物，结合临床上常用于治疗PA感染的药物制定联合方案。
3.联合药敏实验：以4×MIC为最高浓度，设计7个倍比稀释梯度(4×MIC-1/16MIC)，采用棋盘法进行联合药敏实验。
结果：
1.联合方案的制定：共制定了6种联合方案，分别是：粘菌素+环丙沙星，粘菌素+头孢他啶，粘菌素+亚胺培南，粘菌素+氨曲南，粘菌素+哌拉西林/舒巴坦，粘菌素+阿米卡星。
2.两种药物联合后MIC值的变化情况：粘菌素与环丙沙星，头孢他啶等药物联合以后，粘菌素的MIC值变化不大，其它药物的MIC值大多下降15倍。
3.两种药物联合后的部分抑菌指数(Fractional inhibitory concentration index,FICI)：暴露组菌株对不同联合方案的FICI值大多大于1，即大多表现为无关或拮抗作用。临床组菌株对不同联合方案的FICI值大都介于0.5-1之间，即大多表现为相加作用。
结论：
与体外暴露于抗菌药物后得到的MDR-PA相比，粘菌素分别与环丙沙星，头孢他啶，亚胺培南，氨曲南，哌拉西林/舒巴坦，阿米卡星等药物联合以后对临床收集的MDR-PA的抑菌效果较好。
从某医院患者无菌体液中感染细菌的病例调查出发，分析多重耐药的革兰阴性菌感染的危险因素。并在体外将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)暴露于一定条件的头孢他啶或美罗培南，对抗菌药物暴露后耐药的菌株和临床上分离的多重耐药PA(multi-drug resistant PA, MDR-PA)的具体耐药机制进行比较研究。此外，通过体外联合药敏试验比较以粘菌素为基础的联合方案对两组耐药菌株(即抗菌药物暴露后耐药的菌株和临床上分离的耐药菌株)的抑菌效果，以期为临床上治疗多重耐药的PA感染的方案优化提供依据。
一、无菌体液多重耐药的革兰阴性菌感染的危险因素分析
方法：
1.研究设计：对山西省某三甲医院2019年1月1日-2019年6月30日间无菌体液中分离出革兰阴性细菌的所有病人进行回顾性分析。纳入标准是所有在院患者至少一次无菌体液分离出革兰阴性细菌。排除标准是：1)临床资料信息不全或无菌体液检出的细菌无药敏结果判断标准；2)按照保留同一患者相同细菌第一株的原则剔除重复菌株。根据所有病例无菌体液中检出细菌的信息和微生物敏感性检测结果，将所纳入的病例分为两组-多重耐药菌感染组和非多重耐药菌感染组来进行分析。
2.数据收集：查阅纳入患者的病例并收集人口学信息包括性别、年龄等，临床资料包括合并症，既往史，此次住院信息等，以及微生物检查资料包括无菌体液分离出的细菌，药敏结果等。
3.统计分析：连续变量之间的比较分析采用ttest或者nonparametricMann-Whitneytest。分类变量之间的比较分析采用Chi-squaredtest或者Fisherexacttest。对纳入的所有变量进行单因素回归分析，并将单因素分析中P＜0.05的变量纳入多因素Logistic回归分析中来确定多重耐药的革兰阴性菌感染的独立危险因素。P＜0.05认为有统计学差异。
结果：
1.研究设计：最终一共107个病例纳入该研究，其中多重耐药菌感染的病例有51例，非多重耐药菌感染的病例有56例。一共119株革兰阴性菌株纳入该研究，其中多重耐药菌55株，非多重耐药菌64株。
2.标本类型和细菌分布：119株非重复的革兰阴性菌株大多(75%)来自血标本。排名前3位的细菌分别是大肠埃希菌(48%)，肺炎克雷伯菌(13%)和铜绿假单胞菌(10%)。
3.危险因素分析：两组患者的单因素分析表明，有心脏疾病和抗菌药物暴露史的患者无菌体液中更容易分离出多重耐药菌(P＜0.05)。多因素Logistic回归分析表明抗菌药物暴露史是多重耐药的革兰阴性菌感染的独立危险因素(OR,2.404;95%CI,1.058-5.050;P=0.031)。
结论：
抗菌药物暴露史是多重耐药的革兰阴性菌感染的独立危险因素。
二、抗菌药物暴露浓度和暴露时间对PA耐药性的影响
方法：
1.抗菌药物对PA的原始MIC测定：采用琼脂倍比稀释法测定MIC。
2.体外PA暴露于抗菌药物的方法建立：配置含4×MIC，2×MIC，1×MIC，0.5×MIC，0.25×MIC头孢他啶或美罗培南的含药培养基，将菌株分别暴露于相应的含药培养基上培养24h。然后转移至新的含相同浓度药物的培养基上继续培养24h，重复此培养直到第9天。保存培养第1,3,5,7,9天的菌株。
3.保存的体外暴露于抗菌药物后的菌株MIC测定：琼脂倍比稀释法。
4.统计分析：采用重复测量方差分析来研究不同浓度和不同时间的抗菌药物暴露对PA耐药性的影响。主效应分析采用LSD-t检验。计数资料之间的比较采用Chi-squaredtest或者Fisherexacttest。
结果：
1.菌株选择：从微生物实验室检出的全敏感的铜绿假单胞菌中随机选取3株做为实验菌株，分别编号为PA1，PA2，PA3，并定义为原始菌株。
2.PA暴露于抗菌药物后的MIC值：暴露于头孢他啶或美罗培南后，菌株大多变得不敏感。PA连续暴露于4×MIC浓度的美罗培南5天后，PA不仅对美罗培南耐药，也对环丙沙星，头孢他啶耐药，即变为多重耐药菌。
3.暴露浓度和暴露时间对MIC值的影响：暴露于不同浓度的头孢他啶或美罗培南以后，各浓度下MIC值相似(P＞0.05)，即暴露浓度对MIC值影响不大。PA暴露于头孢他啶或美罗培南后，MIC值随着暴露时间的延长整体上看呈现增加的趋势,且MIC值随着时间的延长变化有统计学差异(P＜0.001)。PA暴露于头孢他啶后MIC值在第三天达到最大，之后随着暴露时间的延长MIC值均比第3天降低，但都高于原始的MIC值。PA暴露于美罗培南后，暴露3天的MIC值比暴露1天高，暴露时间为5天，7天和9天的MIC值比暴露3天的高(P＜0.05)；而暴露5天，7天，9天这3个时间点之间两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
4.暴露浓度和暴露时间对不敏感率的影响：暴露于不同浓度的头孢他啶或美罗培南后菌株的不敏感率相似(P＞0.05)。暴露于头孢他啶1天后菌株对头孢他啶不敏感率迅速上升到80%，之后暴露3、5、7、9天后菌株对头孢他啶的不敏感率相似(P=1.000)。暴露于美罗培南1天后，菌株对美罗培南的不敏感率上升到54.5%，暴露3天及以后不敏感率均为100%。
结论：
1.PA暴露于头孢他啶或美罗培南后，不同浓度下MIC值相似；暴露于某一浓度的药物后，MIC值随着暴露时间的延长表现出增加的趋势。
2.PA连续暴露于一定浓度的头孢他啶或美罗培南9天后，菌株的MIC值在前3天增长较快，3天以后MIC值增长缓慢或趋于稳定。
3.在体外长时间连续暴露于一定浓度的美罗培南后PA会变为多重耐药菌。
三、体外诱导和临床上分离的多重耐药铜绿假单胞菌的耐药机制比较
方法：
1.菌株来源：第2部分实验中经抗菌药物暴露以后变为多重耐药的菌株，将该组菌株定义为暴露组。山西省某医院微生物室从临床患者标本中分离的多重耐药铜绿假单胞菌，将该组菌株定义为临床组。
2.对多种药物MIC的测定：采用琼脂倍比稀释法测定对头孢他啶，亚胺培南，氨曲南，哌拉西林/舒巴坦，阿米卡星和粘菌素的MIC值。
3.常见耐药基因的扩增：根据TIANampBacteriaDNAKit的操作步骤提取DNA，然后根据2×SanTaqPCRMix预混液(含蓝染料)的指示步骤建立PCR反应体系扩增耐药基因。扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳。
4.外排泵基因表达量的测定：根据柱式细菌总RNA抽提纯化试剂盒的操作步骤提取RNA，然后根据MightyScript第一链cDNA合成MasterMix试剂盒指示进行反转录，最后根据2×RealtimePCRSupermix(SYBRgreen, with anti-Taq)指示步骤建立荧光定量PCR反应体系测定基因表达量。
5.统计分析：两组菌株外排泵基因表达量的比较采用nonparametricMann-Whitneytest。
结果：
1.菌株选择：第2部分实验中暴露于美罗培南后得到3株多重耐药菌，分别编号为PA3-5,PA3-7,PA3-9。从临床上收集的39株MDR-PA分离株中筛选出了6株与上述3株菌MIC值相近的菌株，分别编号为PA4,PA5,PA6,PA7,PA8,PA9。上述9株菌用于该部分实验。
2.菌株对6种药物的MIC值：这9株菌除对粘菌素敏感外，对其它5种药物都耐药。
3.耐药基因的检测：暴露组菌株携带CTX-M1，TEM，IMP等编码β-内酰胺酶的基因，且oprD基因都缺失。临床组菌株携带SHV、IMP、ant(6’)-I等基因，且oprD基因都存在。
4.外排泵基因的表达量：暴露组菌株mexA基因和mexX基因表达量上调。临床组菌株mexA，mexC，mexE，mexX外排泵基因表达量都上调。暴露组菌株mexA基因表达量比临床组明显上调(P＜0.05)，而临床组菌株的mexC和mexE基因表达量比暴露组明显上调(P＜0.05)。
结论：
1.临床上收集的MDR-PA耐药机制主要是产生SHV、IMP两种β-内酰胺酶和外排泵基因表达量上调。
2.体外长时间暴露于美罗培南后，PA通过多种机制包括产生多种β-内酰胺酶，oprD基因缺失或mexA外排泵基因高表达获得多药耐药性。
四、以粘菌素为基础的联合方案对暴露组和临床组的MDR-PA的抑菌效果比较
方法：
1.菌株选择：采用第3部分实验中的9株菌。
2.联合方案的制定：以粘菌素为基础药物，结合临床上常用于治疗PA感染的药物制定联合方案。
3.联合药敏实验：以4×MIC为最高浓度，设计7个倍比稀释梯度(4×MIC-1/16MIC)，采用棋盘法进行联合药敏实验。
结果：
1.联合方案的制定：共制定了6种联合方案，分别是：粘菌素+环丙沙星，粘菌素+头孢他啶，粘菌素+亚胺培南，粘菌素+氨曲南，粘菌素+哌拉西林/舒巴坦，粘菌素+阿米卡星。
2.两种药物联合后MIC值的变化情况：粘菌素与环丙沙星，头孢他啶等药物联合以后，粘菌素的MIC值变化不大，其它药物的MIC值大多下降15倍。
3.两种药物联合后的部分抑菌指数(Fractional inhibitory concentration index,FICI)：暴露组菌株对不同联合方案的FICI值大多大于1，即大多表现为无关或拮抗作用。临床组菌株对不同联合方案的FICI值大都介于0.5-1之间，即大多表现为相加作用。
结论：
与体外暴露于抗菌药物后得到的MDR-PA相比，粘菌素分别与环丙沙星，头孢他啶，亚胺培南，氨曲南，哌拉西林/舒巴坦，阿米卡星等药物联合以后对临床收集的MDR-PA的抑菌效果较好。