目的：　　纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)是机体丰度最高的凝血因子，在凝血酶作用下转变成为纤维蛋白，发挥其生理功能。一方面，纤维蛋白可以相互交联，和血细胞及其他凝血因子共同聚集，参与止血过程;另一方面，纤维蛋白的形成又可以纤溶系统的激活，防止血栓形成。因此，作为共同凝血途径中重要的凝血因子，纤维蛋白原在机体维持出血与止血平衡中发挥重要作用。遗传性异常纤维蛋白原血症(inherited dysfibrinogenemia)是一种罕见的常染色体杂合显性遗传病，小部分为纯合显性遗传。遗传性异常纤维蛋白原血症发病率低并且患者症状轻微较隐匿，FIB基因复杂，需要从分子发病机制上才能得出完整诊断。本研究对1例纯合突变的遗传性异常纤维蛋白原血症患者及家系成员进行表型及基因分析，并从功能上加以分析，共同探讨其相关的分子发病机制。　　方法：　　（一）、研究对象　　1.家系资料:先证者，男，57岁，籍贯浙江杭州，因“消瘦半年”就诊，实验室检查发现凝血酶原时间(prothrombin time，PT)及凝血酶时间(thrombin time，TT)延长，活化部分凝血活酶时间(activated partialthromboplastin time，APTT)正常，纤维蛋白原活性明显降低。平素无自发出血或血栓病史，肝、肾功能正常。该家系共有4代19人，无近亲婚配史，其他成员均无自发出血或血栓病史，其女儿有习惯性流产史。　　2.正常对照者:我院健康体检者100例，男性60名，女性40名，平均35(23-56)岁。对照组采样前均取得知情同意，且经查实均无肝肾功能疾病，无出血或血栓性疾病史。　　（二）、研究方法　　1.样本收集及处理　　在知情同意的情况下，采集患者、家系成员及对照组体检者静脉血，以0.109mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝，4℃1500g离心15min，分装血浆于-80℃低温保存。抽提外周血细胞基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)，-80℃保存备用。　　2.凝血指标检测　　使用Sysmex CA-7000全自动凝血分析仪，采用凝固法测定FIB活性及PT、APTT、TT,免疫浊度法测定血浆D-二聚体(D-Dimer);使用SIEMENS BN-Ⅱ蛋白分析仪采用免疫散射比浊法测定FIB抗原含量。所有操作均按照试剂说明书进行。　　3.家系基因分析　　根据FIB基因序列（GenBank FGB ID:2244 FGA ID:2243 FGG ID:2266），应用Primer Premier5.0软件，设计23对引物以覆盖FIB基因的24个外显子区域及其启动子序列。在Genepro TC-E DNA扩增仪进行聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳条带鉴定，将不同批次PCR产物分别送上海英潍捷基公司和广州华大基因公司正反向测序。用Genetyx软件将测序结果与美国国立生物信息中心(National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)中的FIB基因序列（GenBank FGB ID:2244 FGA ID:2243 FGG ID:2266）进行比对(Blast)，找寻基因突变位点;使用Chromas软件查看突变位点的峰图，确定突变性质。　　4.纤维蛋白原突变体检测　　将先证者家系所有成员枸橼酸钠抗凝外周血血浆用磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline，PBS)1∶200倍稀释，血浆加入上样样缓冲液后100℃加热变性5 min，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）（5％浓缩胶，8％分离胶）分离后，100 V恒压2h，湿转至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜。牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）室温封闭2h，一抗用兔抗人纤维蛋白原多抗室温孵育2h，二抗用辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔IgG抗体室温孵育1h。电化学发光法(Electro Chemical Luminescence，ECL)检测FIB蛋白，将显影条带与健康对照人群FIB条带比对，判断该家系是否存在FIB突变体。　　5.纤维蛋白原功能检测　　采用美国Haemoscope TEG5000血栓弹力图仪，按照仪器操作说明及试剂说明书，将先证者家系所有成员的枸橼酸钠抗凝外周血进行血栓弹力图(thromboelastogram，TEG)检测，分析其凝血功能。　　6.异常纤维蛋白原结构与功能预测　　使用NCBI开放阅读框寻找工具(Open Reading Frame Finder，ORF Finder)对纤维蛋白原野生型和突变型序列进行在线分析，并根据两个分析结果分别作后续表达产物（氨基酸）序列一级、二级及空间结构分析预测。最后将野生型序列提交蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB），对比分析纤维蛋白原的三维空间结构，对其结构功能进行预测。　　结果：　　1.凝血指标检测　　先证者APTT、D-Dimer均正常，PT和TT显著延长，纤维蛋白原活性检测较低（Cluass法），抗原含量（免疫散射比浊）检测在正常范围内。先证者母亲、妹妹、弟弟、女儿凝血指标与先证者相似，PT和TT延长，纤维蛋白原活性有不同程度减低，家系其他成员及健康对照凝血指标均正常。　　2.家系基因型检测　　先证者FGG第8外显子上g.1001 A＞C(p.Asn308Thr)纯合突变，导致γ链第308位天冬酰胺（asparagine，Asn）突变为苏氨酸(threonine，Thr)。家系中，先证者弟弟该位点也为纯合突变，但是先证者母亲、妹妹和女儿在该位点为杂合突变，家系其他人在此位点上无突变。　　3.纤维蛋白原突变体检测　　对先证者家系成员血浆进行免疫印迹检测，与健康人群混合血浆条带Aα、Bβ、γ链比较未发现纤维蛋白原突变体。　　4.纤维蛋白原功能检测　　与健康对照相比，先证者母亲、妹妹和女儿TEG均呈现类似的低角度，最大振幅正常的血栓弹力图，提示其血小板功能正常，纤维蛋白原功能降低。然而先证者及Ⅱ-3血栓弹力图均呈现更低的角度，最大振幅正常，提示更为严重的纤维蛋白原功能降低，血小板功能正常。家系其他成员血栓弹力图均正常。　　5.纤维蛋白原突变体蛋白结构与功能预测　　突变位点γ链308Asn位于纤维蛋白原交联的结合界面处，对于纤维蛋白原聚合为纤维蛋白具有重要作用。Asn308Thr的突变影响了纤维蛋白结构的稳定性，导致家系突变成员TT、PT延长及凝血共同途径受损。　　结论：　　1.该遗传性纤维蛋白原血症家系先证者纤维蛋白原FGGγ链第8外显子存在显性纯合型错义突变Asn308Thr，推测先证者父亲该位点为杂合突变。　　2.Asn308Thr多态性与该家系纤维蛋白原活性降低有关。