据美国化学文摘社(chemical abstract service,CAS)统计,目前已有超过1.2亿种注册化合物,且数量仍在不断增加,其中很多化合物已被证明具有内分泌干扰活性。但到目前为止,仍有大量具有潜在内分泌干扰活性的化合物未被有效识别。从技术角度看,当前广泛使用实验室测定法面临成本高、速度慢等因素制约,无法大规模进行化合物内分泌干扰活性识别;而近年来广受关注、被寄予厚望的定量结构-活性关系(quantitative structure-activity relationship,QSAR)单独使用时会出现“假阳性”现象,使其只能定量预测已知有活性但活性值未知的化合物的活性,所以无法真正替代实验室检测并进行实际运用。但进一步分析发现,QSAR存在的内在缺陷也为我们提供了一个解决该问题思路,即如果能首先建立化合物活性定性区分方法,判断并筛除无活性化合物,将确定具有活性的化合物进行QSAR建模并定量预测,就能将包括无活性和有活性化合物在内的所有化合物的活性准确地进行识别。建立定性区分方法的关键在于确定化合物产生内分泌干扰活性的关键过程。在有害结局通路(adverse outcome pathway,AOP)经典描述中可知,化合物暴露后,首先要进行分子层面的相互作用,而后才会出现细胞层面反应,再之后才能在组织器官、生物机体甚至种群层面产生效应。所以,分子间相互作用是化合物产生内分泌干扰活性,进而导致效应的关键步骤。对于核受体而言,分子间相互作用一般过程主要包括:受体-配体对接并形成复合物,复合物内的受体和配体相互作用并达到稳定状态,稳定了的复合物进行同源或异源二聚(四聚)化,在共调节因子的影响下,最终激活下游基因表达。其中,复合物内的受体和配体相互作用并达到稳定状态是化合物产生内分泌干扰活性的关键步骤,能定性确定化合物是否具有潜在活性;同源或异源二聚(四聚)化和共调节因子是影响化合物内分泌干扰活性及产生内分泌干扰效应的重要步骤,和复合物内的受体和配体相互作用并达到稳定状态这一关键步骤结合,能用于判断化合物能否最终产生内分泌干扰效应,并识别产生效应的关键因子。在计算机模拟方法中,分子动力学模拟(moleculardynamic,MD)能描述化合物于空间中的运动轨迹,模拟分子微观行为,为评价配体小分子与生物大分子的相互作用情况以及判断复合物稳定构型提供帮助。因此,本研究利用MD特点,通过分析化合物与受体之间的相互作用,结合不同核受体同源或异源二聚(四聚)化过程的区别和共调节因子的影响,实现2个主要研究目标:(1)建立黄酮类、多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)化合物抗雄活性定性区分方法,并与QSAR相结合,构建定性区分和定量预测相结合的化合物活性预测体系。(2)模拟磷酸三(2-氯)乙基酯(TCEP)与斑马鱼核受体之间的相互作用,与TCEP在低浓度下对模式生物斑马鱼9种核受体、70个相关基因的调控反应,及高浓度下对组织器官、生物机体层面的内分泌干扰效应相结合,综合核受体在内分泌干扰调控通路之间的相互影响,分析化合物对斑马鱼基因调控网络非协调性表达的影响,并识别产生有害结果的关键介导核受体。此外,还将构建的抗雄活性定性区分法推广运用于PBDE类化合物抗糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor,GR)定性区分方法的建立,分析定性区分方法的适用性。(1)构建定性区分和定量预测相结合的化合物活性预测体系。本研究的第二、第三章运用MD,模拟并分析了影响受体-配体相互作用并达到稳定状态这一关键过程中配体逃逸、受体“鼠夹”、氢键变化、受体和配体的稳定性等关键因素,分别建立了黄酮类、PBDEs化合物抗雄活性定性区分模型。在黄酮类化合物与雄激素受体(androgenreceptor,AR)相互作用并达到稳定过程中,发现3-羟基-6-甲氧基黄酮从受体结合腔中逃逸,6-甲氧基黄烷酮被受体“鼠夹”,在A环有甲氧基但很少与AR结合腔关键氨基酸残基形成氢键的化合物无抗雄活性,94.1%的抗雄活性和79.3%的无抗雄活性黄酮可通过配体均方根差(root-mean-square deviation,RMSD)稳定性进行区分,85.4%的化合物活性可以通过受体稳定性进行区分。基于此,将这些关键因素根据各自特点相互结合,最终构建了整体定性识别率达85.4%,无活性筛除率超过90%的黄酮类化合物抗雄活性定性区分方法。对于PBDEs而言,由于其不与AR形成氢键,也未出现配体逃逸和“鼠夹”现象,受体和配体均能在短时间能达到稳定状态。因此,使用主成分分析法(principal component analysis,PCA)综合分析1-10ns间配体和受体的稳定性,建立了整体区分率达90.5%的定性区分模型。这些定性区分模型不依赖具体实验室测定,能高效、准确地识别化合物的活性,将其与传统QSAR建立的定量预测模型相结合,能形成一套新的判断化合物抗雄活性的预测体系,从而大幅减少内分泌干扰实验室测定、降低工作成本、提升识别效率。为考察所建抗雄活性定性区分方法的适用性,本研究的第四章尝试将第二、三章中定性区分方法推广运用于糖皮质激素受体(GR),构建PBDE类化合物抗GR活性区分法。研究发现,所有配体稳定性较高,均具有潜在活性;基于受体稳定性建立的区分模型的总体区分率达88.2%。但与第二、三章不同,本章模型中活性化合物集中在模型中部,推测可能与GR受体抑制转录是一种间接作用有关,说明不同核受体定性区分方法的建立要与其转录特点相结合,值得进一步研究。(2)分析TCEP产生斑马鱼核受体基因非协调性表达原因,识别产生有害结果的关键核受体。本研究第五章通过MD分析TCEP对斑马鱼受体调控通路的影响,识别产生基因网络非协调性表达和内分泌干扰效应的关键核受体。首先,通过水暴露实验,观察到高浓度TCEP对模式生物斑马鱼胚胎/幼鱼产生了内分泌干扰效应,并测定了低浓度TCEP对9种核受体、70个基因产生了调控反应,从而确定了 TCEP在细胞和组织器官层面均能产生内分泌干扰负效应,构建了基因网络调控图。其次,通过MD模拟TCEP与9种核受体之间的相互作用,观察受体-配体的稳定性,确定是否具有潜在活性。在此基础上,结合不同核受体转录特点及共调节因子的影响,与所测定的基因调控结果进行对比,最终识别TCEP对斑马鱼基因网络非协调性表达的影响,结果如下:(1)类雌激素类受体,如AR、雌激素受体(estrogen receptor,ER)、GR、盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)和孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR),由于其只进行同源二聚化,因此在模拟过程中能与TCEP形成稳定复合物的受体均能稳定转录上调;(2)维甲酸X受体(retinoid X receptor,RXRs)能与甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor,ThR)、维甲酸受体(retinoic acid receptor,RAR)、过氧化物酶体增殖体激活受体(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)进行异源二聚化,影响着它们的转录表达,是重要核受体。其中,RXRs中的rxraa和rxrab受体与TCEP形成的复合物无法达到稳定状态,因此TCEP无法对其产生转录调控;raraa受体虽然能与TCEP形成稳定复合物,但其只能与rxraa异源二聚化,因此无调控效应;(3)甲状腺激素类受体,如ThR和PPAR,既能与RXR进行异源二聚化,也能进行同源二聚化,且在模拟过程中能与TCEP形成稳定复合物,因此能产生转录调控。(4)共调节因子影响了最终转录表达,由于几乎所有的共激活因子是ER的下游基因、所有的共抑制因子是ThR的下游基因,所以ER和ThR可通过共调节因子影响其余核受体的转录表达。因此,影响TCEP对斑马鱼产生内分泌干扰负效应及基因网络非协调性表达的关键核受体是ER、ThR和RXRs。