【摘 要】
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目的:研究肝癌相关抗原kinectin基因片断体外重组表达的方法,探讨高效表达及纯化的条件,为进一步开发应用该抗原打下基础。方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原kinectin的基因片断,
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目的:研究肝癌相关抗原kinectin基因片断体外重组表达的方法,探讨高效表达及纯化的条件,为进一步开发应用该抗原打下基础。方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原kinectin的基因片断,将目的基因插入表达载体pMAL-C2的麦芽糖结合蛋白基因下游,转化DH5α菌,通过蓝白斑筛选、PCR鉴定、内切酶鉴定及DNA测序筛选出正确的重组子,并用其转化TB1菌。采用不同的诱导温度、诱导时间、诱导剂IPTG浓度及IPTG加入时机对工程菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定,并用Quantity one凝胶分析软件进行分析,以找出最适诱导条件。按优化条件诱导的工程菌超声破碎后,上清液过Amylose-resin亲和层析柱,对过柱纯化条件进行优化,以获取纯化的MBP-kinectin融合蛋白。结果:目的基因正确插入载体质粒的多克隆位点,并成功诱导表达出MBP-kinectin融合蛋白。工程菌在34℃诱导时不仅可以获得较高的目的蛋白产量,且其可溶性部分所占的比例也较高;工程菌在诱导的最初3个小时内,目的蛋白表达量会随着诱导时间的延长而增加,但超过3个小时,则会明显下降;IPTG终浓度为1mmol/L时,诱导效率最高;IPTG在工程菌37℃振荡培养2个小时后加入,可获得较优诱导效果。过柱纯化后的MBP-Kinectin融合蛋白电泳后可见一些分子量介于MBP和MBP-Kinectin之间的蛋白条带,降低破菌及过柱温度,并抑制蛋白酶的活性,可减少蛋白杂带的出现。结论:pMAL-C2载体可成功用于重组表达kinectin片断蛋白;在培养基中加入0.2%葡萄糖,37℃振荡培养两个小时后加入IPTG(终浓度为1mmol/L),34℃诱导3个小时,在冰浴中破菌并加入蛋白酶抑制剂PMSF
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