鸭屠宰场中细菌的耐药性及qnrB耐药基因的传播机制研究

来源 :浙江工商大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dianzishu1981
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抗生素作为生长促进剂、细菌性疾病治疗药物被广泛用于畜禽业中,由于抗生素的乱用及滥用,细菌耐药基因产生,并可通过食物链传递至人体。本课题旨在研究家禽屠宰场中肉鸭和蛋鸭的抗生素耐药情况,并探讨质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrB的水平传播机制。(1)分别采集屠宰场待宰区中蛋鸭和肉鸭的粪便混合样及污水混合样,通过宏基因组测序从整体角度对肉鸭源样品和蛋鸭源样品的微生物结构及微生物耐药性进行分析。在微生物结构分布上,细菌、真菌、古细菌、病毒皆有所检出,其中,细菌为主要组成成分(90%以上)。在细菌属的分类学水平上,肉鸭源细菌的主要菌属为嗜冷杆菌属、不动杆菌属、食酸菌属、棒杆菌属和假单胞菌属,蛋鸭源细菌的主要菌属为棒杆菌属、嗜冷杆菌属以及不动杆菌属。在微生物耐药性上,本次分析共匹配到320种耐药基因对应78种抗生素,肉鸭源微生物和蛋鸭源微生物共同含有287种耐药基因对应71种抗生素耐药,两者的前4种抗生素耐药类型都为大环内酯、万古霉素、林可酰胺、杆菌肽,耐药基因检出都以大环内酯类外排泵基因mac B和杆菌肽外排泵基因bcr A为主,其余耐药基因丰度皆不超过0.1%。此外,肉鸭源微生物含有21种特有基因耐药基因对应8类抗生素耐药,而蛋鸭源微生物则含有12种特有耐药基因对应4类抗生素耐药。宏基因组测序结果显示,肉鸭源样品中微生物丰度高于5%的细菌种类多于蛋鸭源样品,肉鸭源微生物的抗生素耐药基因种类比蛋鸭源微生物丰富,但蛋鸭源微生物的总耐药基因相对丰度更高。(2)利用K-B药敏实验和PCR技术探究肠杆菌科细菌的耐药表型构成及耐药基因型分布情况,以此评估两待宰区的细菌耐药性差异。通过16s r RNA技术分别从肉鸭待宰区、蛋鸭待宰区中鉴定出70株、192株肠杆菌,其中大肠埃希氏菌为优势菌(70%以上),其余菌属为肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌以及志贺氏菌,肉鸭源细菌和蛋鸭源细菌的肠杆菌菌群分布相似。K-B实验表明,在9大类24种抗生素中,本次分离的多重耐药菌都对苯唑西林、阿莫西林耐药率最高(98%以上),都对美罗培南、米诺环素、多粘菌素的耐药率最低(6%以下),此外,蛋鸭源重度耐药菌(细菌对实验所用抗生素中的16种以上耐药)比例为6.2%,高于肉鸭源重度耐药菌(1.5%)。PCR耐药基因检测结果表明,9大类耐药基因中检出率最高的分别为sul1(磺胺类)、fos X(磷霉素类)、aac(6’)-Ib-cr(氨基糖苷类)、mcr-1(多粘菌素类)、cat A3(氯霉素类)、tet A(四环素类)、erm A(大环内酯类)、bla TEM(产超广谱β-内酰胺酶类)和qnr S(喹诺酮类)。蛋鸭源细菌的耐药基因检出率与肉鸭源细菌存在差异,实验发现蛋鸭源细菌对aac(6’)-Ib-cr、mcr-1、flo R的检出率显著较高,肉鸭源细菌则对bla CTX-M的检出率显著较高(P<0.05),其它耐药基因的检出率无显著差异。K-B实验和PCR实验均表明,蛋鸭源细菌的耐药形势更严峻。(3)以分离自蛋鸭待宰区的qnrB阳性菌为研究对象,通过质粒的生物信息学分析探究喹诺酮类耐药基因的传播机制。通过接合转移实验验证了qnrB基因位于质粒上并可进行水平转移。从接合子中提取的质粒p2008-qnrB属于Inc FIIk型质粒,其骨架区被多个外源插入区打断,外源插入区内含有耐药基因为aac(3)-IId、bla TEM-1b、flo R、tet(A)、arr3、dfr A27、aac(6’)-Ib-cr、aad A16、sul1、qnrB2、mph(A)、aph(3’)-Ia等,都集中于MDR区。在质粒p2008-qnrB中,qnrB2由ISCR1-qnrB2-sul1-IS6100转座单元带入,IS6100的存在可促进qnrB2在细菌染色体、质粒之间的进行转移从而传播抗性。此外,ISCR1-qnrB2-sul1-IS6100转座单元的上游为整合子In1021,可与qnrB2共存并共同转移,促进qnrB2的传播,其携带的aac(6’)-Ib-cr耐药基因可与qnrB2共同表达,提高细菌对喹诺酮类抗生素的耐药水平。本课题发现在该鸭屠宰场待宰区中,蛋鸭源细菌的耐药情况更加严重,对蛋鸭源细菌的耐药质粒p2008-qnrB进行生物信息学分析可知,qnrB耐药基因以质粒为载体,通过整合子In1021以及ISCR1、IS6100等可移动元件,促进了qnrB及细菌耐药性的传播。本课题为养鸭业的合理用药提供了一定的参考,对延缓细菌耐药性传播及保障食品安全有着重要的意义。
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