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研究背景:多糖是所有生命有机体的重要组分,在调节细胞生长、控制细胞分裂、维持生命体正常代谢等方面具有重要作用。近年来,海洋生物多糖的结构和活性不断得到揭示和研究,已成为“蓝色药库”的重要组成部分。乌贼墨多糖是一种重要的海洋生物多糖,在抗肿瘤、抗氧化、抗突变、免疫调节、化疗保护等多方面显示出良好的潜力。曼氏无针乌贼（Sepiellamaindroni）是中国沿海产量最高的一种经济头足类动物,2004年本课题组最先从其墨汁中提取得到曼氏无针乌贼墨多糖（polysaccharide of maindroni ink,SIP）。在此后的研究中,曼氏无针乌贼墨多糖及其硫酸化衍生物的结构和性质得到进一步揭示。研究目的:多糖的生物活性与分子量密切相关。一般情况下,低分子量多糖在生物体内的透过性更强、生物利用度更高,并可能产生新的生物活性。因此,本课题旨在对SIP进行降解,获得低分子量片段,并探讨低分子量SIP（low molecular weight polysaccharides of Sepiella maindroni ink,LMWSIPs）的生物活性。研究方法:（1）通过高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography,HPGPC）和OD232nm紫外法检测常见的糖苷酶是否能够降解SIP。（2）选用三氟乙酸（trifluoroacetic anhydride,TFA）降解SIP,通过高效薄层色谱（high performance thin layer chromatography,HPTLC）法确定最适降解条件。（3）通过Sephadex G-50分离纯化SIP降解产物,之后利用HPGPC法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）法检测降解产物的分子量。（4）按照分子量分布范围对降解产物进行分组及命名,得到LMWSIP-1、LMWSIP-2和LMWSIP-3,通过红外光谱和1H核磁共振（1H nuclear magnetic resonance,1H NMR）分析LMWSIPs与SIP在结构上的差异。（5）利用MTT法检测LMWSIPs与SIP抗肿瘤细胞增殖的活性及差异。（6）利用流式细胞术检测LMWSIPs与SIP诱导肿瘤细胞凋亡的活性及差异。（7）利用划痕法检测LMWSIPs与SIP抗肿瘤细胞转移的活性及差异。（8）通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH radical,·DPPH）清除实验、羟基自由基（hydroxyl radical,.OH）清除实验、2,2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（diammonium 2,2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）,ABTS）法检测总抗氧化能力实验、铁离子还原能力（ferric ion reducing anti-oxidation power,FRAP）法检测总抗氧化能力实验,评价LMWSIPs与SIP抗氧化的活性及差异。（9）利用CCK-8法检测LMWSIPs与SIP刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的活性及差异,并检测LMWSIPs与SIP对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。研究结果:（1）SIP不能被常见的糖苷酶,如透明质酸酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、甲壳素酶、纤维素酶降解。（2）SIP在水溶液中的浓度为2 mg/mL时,最适酸降解条件为:0.5 mol/L TFA、80℃、3.5h。（3）TFA降解法可获得分子量分布范围为1.8 kDa～9.4 kDa的LMWSIPs。分子量分布范围为7 kDa～9 kDa、5 kDa～7 kDa、3 kDa～5 kDa的3组样品分别命名为 LMWSIP-1、LMWSIP-2、LMWSIP-3。HPGPC 结果显示,利用 Sephadex G-50凝胶柱层析分离纯化的各降解组分纯度较高。MAIDI-TOF MS对样品分子量的测试结果与HPGPC差别不大。（4）LMWSIP-1、LMWSIP-2与SIP相比,一级结构相同,仅聚合程度降低;LMWSIP-3与SIP相比,推测其一级结构已发生变化,从单糖单位上游离出羧基、羟基等极性基团。（5）在一定浓度下,LMWSIP-2抗肿瘤增殖、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞迁移的活性显著高于SIP和其余组降解产物。（6）SIP在降解后,对·DPPH、·OH的清除能力和总抗氧化能力没有发生显著变化。（7）SIP、LMWSIP-1、LMWSIP-2在各浓度下均能显著促进脾淋巴细胞增殖,但LMWSIP-3需要在高浓度时才能发挥此作用。在一定浓度范围内,LMWSIP-2对脾淋巴细胞增殖的促进作用显著高于SIP和其余组降解产物。（8）各浓度条件下,SIP和LMWSIPs对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖的促进作用均没有显著差异;在高浓度条件下,LMWSIPs能够显著增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖作用。研究结论:本课题建立了制备LMWSIPs的方法,并对LMWSIPs的抗肿瘤、抗氧化、免疫调节活性进行了初步研究。本课题发现,LMWSIPs的分子量在5 kDa以上时,与SIP相比,一级结构没有发生变化,仅存在聚合度的变化;当LMWSIPs的分子量低于5 kDa时,多糖的一级结构被破坏,单糖残基的结构也可能被破坏。在一定浓度下,5 kDa～7 kDa的LMWSIPs在抗肿瘤、增强免疫活性方面强于SIP和其余分子量的LMWSIPs。LMWSIPs的抗氧化活性与SIP相比没有显著差异。本课题研究结果提示,SIP及其一定分子量的降解产物不仅能够直接作用于肿瘤细胞,还能够通过增强机体免疫功能发挥抗肿瘤作用,但具体机制尚需进一步揭示。此外,SIP存在典型的分子量与生物活性相关性。综上,本课题的研究为SIP的进一步研究和开发提供了依据。