牛病毒性腹泻病毒/粘膜病病毒（BVDV/MDV）可以在牛,羊和猪中引起急性,发烧,接触性传染病,称为牛病毒性腹泻/粘膜病。它们大多数是隐性感染,还可引起持续性感染。这种疾病给世界养牛业带来了重大的经济损失。目前,尚无针对该疾病有效的治疗方法,主要以预防为主。近年来研究表明BVDV的重要功能蛋白E0、E2、NS3和NS5A参与病毒复制、变异等重要生物学功能,是研发抗BVDV治疗药物的重要靶蛋白。纳米抗体的优点是体积小,特异性强,耐高温,易于在原核系统中表达,具有强大的组织穿透力,稳定性高,甚至可口服吸收而不被降解。目前,关于人类病毒纳米抗体的研究很多,并且显示出良好的抗病毒作用,但是纳米抗体在动物病毒的研究较少。研发纳米抗体药物在疾病的诊断和治疗上具有广阔前景。目的:使用噬菌体展示技术筛选针对BVDV重要功能蛋白的特定纳米抗体,得到高效特异性的纳米抗体并探究其抗病毒活性及功能,为BVDV的防治以及研发抗BVDV纳米抗体药物提供试验依据及候选材料。方法:（1）用BVDV灭活病毒免疫羊驼,分离外周血淋巴细胞以提取总RNA,逆转录为c DNA,然后使用巢式PCR扩增纳米抗体基因,将其克隆至p CANTAB-5E表达载体,并将其转化进大肠杆菌TG1感受态细胞,菌液PCR鉴定目的基因插入率和文库容量;初始纳米抗体文库经辅助噬菌体（M13K07）救援并扩繁。经三轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和淘选,用ELISA方法鉴定其反应性。（2）经测序鉴定后,构建了具有良好特异性的纳米抗体基因p ET-30a的重组表达载体,将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,并通过IPTG诱导表达,并通过Ni-IDA+亲和层析柱纯化。通过ELISA和WB检测其反应原性。（3）将BVDV病毒和纳米抗体Nb2、Nb3、Nb-YT分别混合后孵育,接种于铺满培养皿约80%的MDBK细胞,进行q RT-PCR分析不同浓度纳米抗体对BVDV病毒复制的阻断作用。（4）对小鼠口服BVDV病毒后进行抗BVDV纳米抗体治疗,取脾脏、肾脏、肝脏、肺脏、肠混合样本进行q RT-PCR,分析体重变化及BVDV拷贝数的表达变化。结果:（1）获得纳米抗体初始文库容量为1.52×107CFU/m L,插入率为92.8%。经辅助噬菌体拯救后的噬菌体展示文库容量为1.84×1014CFU/m L。（2）经过三轮筛淘后,经测序得到7种不同氨基酸序列的纳米抗体,其中3种与E2蛋白结合的纳米抗体,1种与NS3蛋白结合的纳米抗体,1种与NS5A蛋白结合的纳米抗体,2种与E0蛋白结合的纳米抗体,ELISA结果显示均具有良好的反应原性。（3）成功构建其中3种纳米抗体Nb2、Nb3、Nb-YT蛋白的重组质粒,并获得重组纳米抗体蛋白Nb2、Nb3、Nb-YT,分子量大小约15 Ku,经WB和ELISA检测反应原性良好。（4）经细胞试验及动物试验进行q RT-PCR验证,纳米抗体Nb2、Nb3、Nb-YT均对病毒有一定中和能力,其中纳米抗体Nb-YT使BVDV拷贝数相比阳性对照组下降了10倍以上且具有一定稳定性。结论:（1）建立BVDV纳米抗体噬菌体展示文库,针对BVDV重要功能蛋白筛选到相应的纳米抗体。（2）利用大肠杆菌系统成功表达Nb2、Nb3、Nb-YT纳米抗体,为抗BVDV纳米抗体的生物学功能研究提供生物材料。（3）通过细胞、动物试验证实纳米抗体可以阻断BVDV病毒复制。