论文部分内容阅读
目的:采用高糖高脂饮食诱导建立非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)大鼠模型,通过检测血浆内毒素(lipopolysaccharide,LPS)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和CD68(巨噬细胞标记物)以及内质网应激(endoplasmic reticulum,ERS)重要相关因子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)的表达,观察大鼠肝细胞凋亡水平变化特点,探讨LPS在大鼠NASH发生发展中的作用机制。方法:1.建立NASH大鼠模型及分组:30只雄性SD大鼠均给予标准基础饲料,自由进食饮水三天后,随机分为9周组:Synthetic diet+saline组(n=5)、Synthetic diet+LPS组(n=5)、Regular diet+LPS组(n=5)和Regular diet+saline组(n=5),另外设立5周组:Synthetic diet组(n=5)和Regular diet组(n=5),并在第5周末将大鼠进行麻醉后处死以观察Synthetic diet对大鼠肝脏影响。Synthetic diet配方为68.75%普通饲料+20%猪油+10%蔗糖+1%胆固醇+0.25%胆酸。自第6周开始,9周组动物在相同条件下隔日皮下注射LPS 0.5mg/Kg或相同剂量的生理盐水,所有大鼠自由进食与饮水。在实验第9周末,1%戊巴比妥钠3ml/Kg腹腔注射麻醉动物,无菌无热原条件下取腹主动脉血,3500rpm离心后取血浆置于–70℃冰箱冻存备用。取部分肝左叶10%福尔马林固定,石蜡包埋,5μm切片,余肝组织置于﹣70℃冰箱备用。2.5周组肝组织切片HE染色,在光镜下观察肝脏病理学变化。采用放免法测定9周组血浆TNF-α水平;赖氏2、4-二硝基苯肼比色法测定9周组血浆ALT活性;鲎试剂法测定9周组血浆LPS水平。采用免疫组织化学方法测定9周组肝脏CD68(巨噬细胞标记物)的表达。采用TUNEL法测定9周组肝细胞凋亡水平。采用Western blot法测定9周组肝组织GRP78蛋白表达量。结果:1.HE染色在光镜下可见5周正常对照组肝组织肝小叶结构完整,肝细胞核圆位于中央,呈条索状排列整齐,以中央静脉为中心呈放射状排列,肝细胞内未见脂滴,而5周高糖高脂饮食组肝细胞体积增大,可见小泡脂滴,细胞轮廓模糊,肝细胞呈轻度脂肪变性。2.9周组中Synthetic diet+saline组血浆LPS、ALT、TNF-α水平显著高于Regular diet+saline组,具有统计学差异(p<0.05);Synthetic diet组经LPS处理后,血浆LPS、ALT、TNF-α水平显著高于Regular diet+LPS组和Synthetic diet+saline组(p<0.05);而在Regular diet组经LPS处理后,与Regular diet+saline组相比血浆LPS、ALT与TNF-α水平无明显变化(p>0.05)。3.9周组中Regular diet+saline组肝脏较少见CD68阳性单核巨噬细胞浸润,当其经LPS处理后CD68阳性细胞无明显增多(p>0.05);Synthetic diet+LPS组(0.140±0.018)可见大量巨噬细胞浸润,CD68阳性表达量与Regular diet+LPS组(0.053±0.018)、Synthetic diet+saline(0.100±0.017)组相比均有显著差异(p<0.05)。4.9周组中Synthetic diet组经LPS处理后GRP78蛋白表达水平明显上调,要显著高于Regular diet+LPS组和Synthetic diet+saline组(p<0.05);Synthetic diet+saline组高于Regular diet+saline组(p<0.05);Regular diet组经LPS处理后与Regular diet+saline组相比无显著差异(p>0.05)。5.在9周正常对照组偶见少量的肝细胞凋亡,经LPS处理后,与正常对照组相比可以看到肝细胞凋亡数量无明显变化,凋亡率无显著差异(p>0.05);Synthetic diet+saline组肝细胞凋亡增多,凋亡率升高,经LPS处理后肝细胞凋亡率达到最高值(57.08±6.21),与Synthetic diet+saline组(32.10±3.64)、Regular diet+LPS组(7.08±2.64)相比均差异显著,有统计学意义(p<0.05)。6.经Pearson’s相关性分析,LPS与ALT表达明显正相关,r=0.78,p<0.05;CD68与TNF-α表达明显相关,r=0.64,p<0.05,GRP78表达量与肝细胞凋亡数呈明显正相关,r=0.77,p<0.05。结论:1.高脂高糖饮食可以诱导建立NASH大鼠模型;2.LPS可对肝脏造成“二次打击”,促进了NASH的发生发展;3.LPS可激活大鼠肝脏巨噬细胞释放大量促炎因子TNF-α;4.在NASH大鼠肝组织中存在内质网应激反应,促炎因子TNF-α可能是引起内质网应激的重要因子,而且内质网应激参与了肝细胞凋亡这一病理过程。