目的：　　HIV能够侵犯中枢神经系统(central nerve system，CNS)，造成HIV相关神经认知功能障碍（HIV-associated neurocognitive disorders，HAND），严重影响患者工作学习能力及生活质量。抗反转录病毒治疗(Antiretroviral treatment，ART)是目前唯一能够控制病毒血症、延长患者寿命的治疗方法。随着HIV患者生存期的延长，ART时代HAND患病人数将越来越多，早期发现并干预可延缓疾病进展，提高患者个体生活质量，减轻社会负担。　　男男同性性传播已成为我国上升速度增长最快的HIV传播途径，男男同性恋(men who have sex with men，MSM)具有独特的行为及心理学特征，其中一些可能与认知功能相关（如抑郁状态），因此HIV感染MSM的认知功能值得关注。由于认知功能受地域、文化影响，目前不同国家报道的MSM人群HAND发生率差异较大，我国尚无针对MSM人群HAND发生情况及临床特征的研究。　　HIV不能直接进入CNS，但能通过感染外周血单核细胞渗透穿过血脑屏障。单核细胞进入CNS后成熟活化，衍生成为巨噬细胞，分泌释放具有神经毒性的病毒颗粒和免疫炎性因子，最终导致神经元死亡。HIV脑病患者尸检结果显示，CNS中存在大量活化的巨噬细胞，因此单核/巨噬细胞是HAND最重要的致病媒介。　　趋化因子是在单核细胞跨血脑屏障过程中起到重要促进作用的一组低分子蛋白。目前已有研究显示HAND患者外周血、脑脊液和脑组织中多种趋化因子(CCL2、IL8等)明显升高。趋化因子可能作用于多种细胞、多种趋化因子受体，找到关键单核细胞表面趋化因子受体有助于明确HAND特异性标志物、了解HAND致病机制。然而，目前对单核细胞趋化因子受体表达情况的报道很少，有限的报道显示HAND患者单核细胞及其亚群CCR2的表达可能与HAND发病相关，但此研究的研究对象包含治疗和未治疗患者，ART治疗已经被认为是CCR2及其他趋化因子受体表达水平的干扰因素，尚缺乏更具说服力的ART治疗后HAND相关趋化因子受体表达及致病机制的研究。　　本研究以中国MSM人群HIV感染者和HIV阴性健康人队列为基础，拟通过规范化的认知功能评价体系，以同地区年龄、文化程度匹配的健康MSM作为参照，对HIV感MSM的认知功能进行评价，分析该人群HAND的临床特征，明确ART时代HAND的关键单核细胞亚群，寻找其表面与致病相关的重要趋化因子受体，并初步阐述其在HAND致病机制中的作用，为解析HAND致病机制、探索ART以外HAND神经保护策略提供线索。　　方法：　　1.研究对象　　(1) HAND临床特征研究:从门诊分别纳入HIV感染MSM84例，及年龄和文化程度匹配的HIV阴性健康MSM对照30例。　　(2)治疗、治疗时机对单核细胞表面趋化因子受体影响研究:纳入71例HIV感染MSM，包括急性期未治疗患者(PHI-nART)3例、急性期治疗患者（PHI-nART）21例、慢性期未治疗患者(CHI-nART)14例和慢性期治疗患者(CHI-ART)33例;纳入12例健康(NC) MSM。　　(3)单核细胞及其亚群表面趋化因子受体与HAND相关性研究:从进行过认知功能测试的HIV感染MSM中筛选出年龄、文化程度匹配的慢性期经ART至少半年患者，包括HAND者（17例）和non-HAND者（12例）。　　(4)原代单核细胞:经治疗病毒血症抑制患者10例用于跨膜迁移实验，慢性期未治疗患者7例用于单核细胞亚群HIVDNA含量差异实验。　　(5)细胞系:人脐静脉血内皮细胞用于跨膜迁移实验，人THP-1细胞用于巨噬细胞极化实验。　　2.HAND的诊断及分类　　(1) HAND诊断:根据Frascati标准，认知功能成套量表包含6个认知领域（言语流利度、注意力/工作记忆、抽象/执行能力、学习记忆、信息处理速度、运动能力），每个领域2个量表。用低于均值至少1个SD评价单个认知领域受损，HAND诊断要求至少2个认知领域受损。合并HIV以外明确原因的认知功能障碍、酗酒、使用毒品或其他认知功能损害药物、重症抑郁症发作期的患者将被排除。　　(2) HAND分类:根据Frascati标准，量表得分低于1个SD、至少2个认知领域受累、无日常生活能力受损被定义为无症状神经认知障碍(asymptomaticneurocognitive impairment，ANI);认知功能量表得分低于1个SD、至少2个认知领域受累、合并日常生活能力受损被定义为轻度神经认知功能障碍(mildneurocognitive impairment，MNI);认知功能量表得分低于2个SD、至少2个认知领域受累、日常生活能力明显受损被定义为HIV相关痴呆(HIV-associated dementia，HAD)。　　3.外周血单核细胞亚群检测　　分离外周血PBMC，流式细胞仪上圈出单核细胞，并根据CD14、CD16的表达进一步分成三个亚群:经典单核细胞(CD14+CD16-)、中间型单核细胞(CD14+CD16+)、非经典单核细胞(CD14lowCD16+)。　　4.单核细胞表面标志物及趋化受体的检测　　分离外周血PBMC，用流式染料CD14、CD16、CCR2、CX3CR1、CXCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CD163、CCR7、CD200R避光染色，在LSRⅡ流式细胞仪上机检测。　　用样品染色管染料平均荧光强度(MFI)与阴性对照管该通道平均荧光强度(MFI)的比值，即MFI ratio来评价来各样本的单核细胞表面趋化因子受体的表达水平。　　5.单核细胞及其亚群跨膜迁移实验　　将2.5×104个脐静脉内皮细胞种入3μm孔径的transwell小室上层，培养3天;第4天在transwell下室中分别加入IL8(300ng/ml)或不加IL8作为对照，37℃孵育1小时。试剂盒阴选出单核细胞（包含CD14+CD16-和CD14+CD16+两个亚群），加到transwell上室约1×106个/孔;24小时后用冰PBS吹打冲洗三次，收下室细胞，流式染色CD14和CD16，加入含等量BD计数微球的PBS300μl混匀后上机。　　6.巨噬细胞极化实验　　(1)THP-1来源巨噬细胞的极化:将THP-1细胞接种到48孔板中，加入50ng/mlPMA孵育6小时，设置不同实验组继续孵育66小时:M1、M2、IL8、对照、M1+IL8、M2+IL8。　　(2)实时定量PCR法检测巨噬细胞极化标志物:　　用QIAGEN试剂盒提取各孔巨噬细胞mRNA，当天将mRNA转录为cDNA，Roche480上进行目的基因CD200R、CD206、CD80、TNF-α和内参基因GAPDH的相对定量检测。采用相对定量法（2-△△Ct法）计算各种刺激下巨噬细胞各目的基因的mRNA相对表达量。　　7.单核细胞亚群HIVDNA含量差异实验　　(1)单核细胞亚群分选:　　从50ml新鲜血中分离PBMC，用试剂盒阴选单核细胞，加入CD14、CD16染料各10μl，Aria流式细胞仪上机分选两路单核细胞:CD14+CD16-和CD14+CD16+，模式为Purity，分选出的两路细胞纯度均＞90％。　　(2)实时定量PCR法检测单核细胞HIVDNA:　　用QIAGEN试剂盒提取单核细胞两个亚群的全基因组DNA，配制引物和探针，用NL43质粒做标准曲线，Roche480上进行HIVDNA的绝对定量检测。　　8.统计学分析方法　　所有数据采用SPSS18.软件分析，连续变量用均值和标准差(standard deviation，SD)表示。连续变量符合正态分布的数据采用t检验进行比较;不符合正态分布的数据采用Mann-Whitney U检验进行比较。同一研究对象的不同细胞间比较采用非参数配对Wilcoxon符号秩检验。Spearman相关性分析用于分析各认知领域异常与HAND与否/严重程度见的关系。HAND相关临床因素用logistic单因素和多因素回归分析进行。统计概率采用双侧检验，p＜0.0.5为统计学有差异。　　结果：　　1.HAND患者26例（约占31.0％），其中ANI、MNI、HAD分别9例(10.7％)、14例(16.7％)和3例(3.6％)。ANI和MNI占所有HAND的88.5％。　　2.所有认知领域异常均与HAND明显相关（所有p＜0.05），执行功能和运动功能异常与HAND严重程度明显相关（所有p＜0.05）。　　3.单因素回归分析发现年龄、文化程度、最低CD4+T细胞数和急性期治疗与HAND明显相关（所有p＜0.05）。　　4.急性期治疗与最低CD4+T细胞数存在关联，分别将最低CD4+T细胞数、急性期治疗这两个因素与年龄和文化程度做多因素回归分析，结果发现最低CD4+T细胞数低是HAND的独立危险因素(p=0.036)，而急性期治疗与HAND无明显相关性(p=0.192)。　　5.抗病毒治疗及治疗时机对单核细胞表面趋化因子受体的影响　　治疗PHI单核细胞CCR2表达高于未治疗PHI(p=0.05);治疗PHI单核细胞CXCR2表达明显高于未治疗PHI(p=0.03)，治疗CHI单核细胞CXCR2表达明显高于未治疗CHI(p＜0.001)。　　6.慢性期经治疗患者的HAND相关单核细胞亚群　　HAND患者CD14+CD16+亚群百分比明显高于non-HAND患者(p＜0.05)，而两组人其他两个亚群百分比未见明显差异（所有p＞0.05）　　7.慢性期经治疗患者单核细胞及其各亚群趋化因子受体表达与HAND的相关性分析　　(1) HAND患者单核细胞表面CXCR1、CCR2表达明显高于non-HAND患者（所有p值均＜0.05），HAND患者单核细胞表面CX3CR1表达有高于non-HAND患者的趋势（p值为0.054），而HAND患者单核细胞表面CXCR2表达明显低于non-HAND患者（p值＜0.05）。　　(2) HAND患者单核细胞CD14+CD16-亚群表面CXCR1、CX3CR1表达明显高于non-HAND患者（所有p值均＜0.05），HAND患者单核细胞CD14+CD16-亚群表面CCR2表达有高于non-HAND患者的趋势（p值为0.069），而HAND患者单核细胞CD14+CD16-亚群表面CXCR2表达明显低于non-HAND患者（p值＜0.05）。　　(3) HAND患者单核细胞CD14+CD16+亚群表面CXCR1表达明显高于non-HAND患者（p值为0.008）。　　(4) HAND患者单核细胞CD14lowCD16+亚群表面CCR5、CD200R表达明显高于non-HAND患者（所有p值均＜0.05），HAND患者单核细胞CD14lowCD16+亚群表面CXCR1和CXCR2表达均有有高于non-HAND患者的趋势（p值分别为0.061和0.065）。　　8.CXCR1在不同细胞及细胞亚群中的表达差异　　CXCR1在单核细胞CD14+CD16+和CD14lowCD16+亚群表达明显高过CD14+CD16-亚群（所有p值均＜0.001）。　　9.单核细胞及其亚群跨膜迁移实验　　(1)IL8/对照组单核细胞跨膜迁移数量比较　　我们将分选出的HIV感染者单核细胞置入提前铺板人脐静脉内皮细胞的tranwell上室，下室放入含IL8或不含IL8的DMEM，孵育24小时。收下室细胞，将IL8组和对照组的下室细胞染色后分别加入等量微球，比较两组细胞/微球比值差异。对比IL8及对照组迁移数量，发现IL8组迁移到tranwell下室的细胞数明显高于对照组(p=0.024)。　　(2)单核细胞各亚群跨膜迁移比较　　单核细胞虽然在跨膜前分三群，但流式图显示迁移24小时tranwell小室下层单核细胞主要有两群:CD14+CD16+和CD14+CD16-。我们以跨膜后两群细胞的百分比比值来评价IL8/对照组中两群的跨膜迁移效率，结果显示无论IL8组还是对照组CD14+CD16+％/CD14+CD16-％在跨膜后明显高过跨膜前（所有p＜0.05）。　　10.IL8对巨噬细胞极化影响实验　　从细胞形态上看，IL8刺激下巨噬细胞呈圆形或椭圆形，无伪足，类似M1型巨噬细胞。　　用实时定量PCR法对各种刺激孔/对照孔目的基因(CD200R、CD206、CD80和TNF-α) mRNA进行相对定量。　　IL8刺激的巨噬细胞CD200R、CD206明显低于M2型巨噬细胞（所有p＜0.05），而与M1巨噬细胞无明显差异（所有p＞0.05）;M2+ IL8组CD206明显高于IL8(p=0.014)。　　IL8刺激的巨噬细胞CD80与M1、M2型巨噬细胞均无明显差异（所有p＞0.05），M1+IL8的CD80明显低于M1型巨噬细胞(p＜0.05); IL8刺激的巨噬细胞TNF-α明显低于M1巨噬细胞(p=0.02)。　　11.单核细胞亚群HIVDNA含量差异研究　　用实时定量PCR法对单核细胞两个主要亚群的HIVDNA含量进行定量检测。结果显示CD14+CD16+的HIVDNA含量明显高于CD14+CD16-(p=0.03)。　　结论：　　1.中国人MSM人群HAND的发生频率约为31％，其中轻型HAND(ANI和MNI)占88.5％;精细运动能力、言语流利度、学习记忆、工作记忆、信息处理速度和执行能力异常均提示患者可能合并HAND，执行能力和运动功能异常提示HAND严重程度可能较重。　　2.CD14+CD16+亚群是HAND相关单核细胞亚群;CXCR1在HAND患者单核细胞及各亚群高表达，是HAND相关单核细胞表面趋化因子受体。　　3.IL8能促进单核细胞跨膜迁移;还可诱导巨噬细胞向M1方向极化;其受体主要存在的单核细胞CD14+CD16+亚群比CD14+CD16-亚群更易跨膜迁移，并且整合更多HIVDNA。