研究背景和目的： 同源异型基因(homeobox genes)是一类包含同源框即183个氨基酸序列(homeobox)的调节基因，能够编码有转录因子功能的同源异型蛋白(homeoproteins)。同源异型基因对于胚胎逐级分化并维持自身在成年组织的表达模式有着重要作用。有些在肿瘤中表达上调的同源异型基因可能在胚胎发育中和未分化细胞中正常表达；相反，有些在肿瘤中表达下调的同源异型基因可能在成年和／或分化细胞中正常表达。目前认为同源异型基因可能是正向或者负向肿瘤调节者，参与癌发生的过程。例如，CDX1和CDX2在结肠中表达缺失，但却普遍表达于肠化组织和胃肿瘤中，与胃癌发生过程中肠分化有关。 PDX1即胰十二指肠同源异型基因(pancreatic duodenal homeobox1)，编码胰十二指肠同源框蛋白1，又称IPF-1、IDX-1、IUF-1。PDX1属于ParaHox家族转录因子的一员，位于染色体13q12.1上，邻近于CDX2。已知PDX1在胰腺，十二指肠及胃窦的发育分化过程中起着重要作用。目前已知PDX1基因在远端胃的内分泌细胞中有表达，其异常表达可能与胃的病理过程如胃粘膜萎缩和化生有关。但PDX1在胃癌发生发展中的功能尚不明了。由此我们假设PDX1可能是胃癌发生发展中的潜在肿瘤调节因子。 本部分研究中，我们旨在阐明PDX1蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达模式，通过体内外研究揭示PDX1在胃癌发生发展中的功能和作用。 材料与方法： 1.实验对象 7株人胃癌细胞购自American Type Culture Collection和取自香港玛丽医院内科系实验室；人胃癌组织标本取自中山大学附属第一医院；雌性BALB／c-nu／nu裸鼠购自香港大学动物中心。 结果： 1.PDX1在胃癌组织和细胞株中的表达下调或缺失7株胃癌细胞N87、SGC7901、AGS、BCG823、KATOⅢ、 MKN45、SNU1仅有低表达或不表达PDX1；PDX1正常表达于慢性胃炎及癌旁正常组织，但在74％(29／39例)的胃癌组织检测不到(p<0.05)；PDX1 mRNA在胃癌组织中的表达显著低于癌旁组织(p<0.05)。 　　2.PDX1和Ki-67的表达呈负相关免疫组化显示Ki-67蛋白表达水平在癌旁组织和胃癌组织中逐渐升高，而相应地PDX1表达水平而逐渐下降，两者有一定负相关(r=-0.771，p<0.05)。 3.PDX1过表达抑制人胃癌细胞增殖并诱导凋亡与空质粒对照比较，转染PDX1的胃癌细胞增殖指数显著下降，同时凋亡指数明显升高(p<0.05)；此外Ki-67表达水平升高，凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9和caspase-10的活性则被激活。 4.PDX1过表达抑制人胃癌细胞克隆形成，伤口愈合和迁移等能力与空质粒对照比较，转染PDX1的胃癌细胞形成的单细胞克隆数明显减少(82±14 × 103 vs 257±67 × 103，p<0.05)；其愈合伤口的速度明显延缓，6h， 12h，24h时间点的伤口愈合率显著降低(10％±0 vs 46.67％±3.33％，21.67％±4.41％ vs76.67％±3.33％，66.67％±8.82％ vs 93.33％±3.33％，p<0.05)；细胞迁移能力亦明显受到抑制0(0.060±0.001 vs 0.274±0.068，p<0.05)。 5.PDX1稳定过表达抑制胃癌细胞的体内成瘤能力接种了SGC-PDX1.6细胞的裸鼠形成的移植瘤全部消失，而接种SGC-pcDNA细胞的裸鼠仅有一个瘤体消失；接种了AGS-PDX1细胞的裸鼠形成的移植瘤体积明显小于对照组(51.6±19.5 mm3 vs 125.7±16.3 mm3，p<0.05)。 结论： 1.PDX1在胃癌中是一个抑癌基因； 2.PDX1在胃癌组织和细胞中表达下调甚至缺失； 3.PDX1与Ki-67在胃癌组织和细胞中的表达呈负向关系； 4.体外PDX1瞬时过表达能抑制胃癌细胞增殖并诱导凋亡； 5.体外PDX1稳定过表达抑制胃癌细胞克隆形成、伤口愈合及迁移能力； 6.体内实验表明PDX1稳定过表达抑制了裸鼠移植瘤的形成和生长． 胃癌研究背景和目的DNA甲基化是一类不改变DNA序列且能遗传下去的化学修饰。已知启动子CpG岛的DNA甲基化能抑制下游基因的转录。目前明确的是启动子CpG岛胞嘧啶甲基化与基因沉默以及癌发生有关。例如PALB2、，DFNA5、NPTX2、，p16、p19、，9p21基因往往都存在CpG岛甲基化。 近来，研究发现CpG岛的甲基化，尤其启动子区域高甲基化与同源异型基因的功能沉默有关。多个研究报道HOXA10、HoxA5和HoxB5、HOXD1、HOXA9和HOXB5、ALX4、PROX1基因存在异常的DNA甲基化，从而引起这些基因表达下调或缺失。另外ParaHox家族的肠特异性同源异型基因CDX1和CDX2亦存在启动子CpG岛甲基化，且与二者在结肠癌，食道癌以及胃癌中的表达下降有关。 我们第一部分研究证实了PDX1是一新的抑癌基因，在胃癌组织和细胞株中表达明显下调，能够抑制胃癌的增殖生长，克隆形成，细胞迁移等能力。但是PDX1在胃癌中表达缺失是否与其启动子CpG岛甲基化有关尚未明了。 本研究旨在确定PDX1可能的启动子区域，以及分析CpG岛在启动子区域的分布情况及评价CpG岛在胃癌细胞株和胃癌组织中的甲基化状态，阐明PDX1基因在胃癌中的表达变化与启动子CpG岛甲基化的关系。 结果： 1.5’-AZA去甲基化促进PDX1基因在人胃癌细胞株中的表达与对照比较，经过5-AZA去甲基化处理后的胃癌细胞(AGS，BCG823，SGC7901，TMK1，SNU1，MKN45)内PDX1 mRNA得到重新表达。而且5-AZA去甲基化处理后的AGS和／或SGC7901表达的PDX1 mRNA有一定的剂量依赖性及时间依赖性。 2.PDX1启动子报告基因活性检测与空载体pGL3-basic转染细胞相比，F383-I1和F314-I2两段报告基因载体转染的细胞均有PDX1启动子活性，但F383-I1表现出最强的启动子活性，有最高的Firefly Luc／Renilla Luc比值。F283-I3和F724-I4转染的细胞则未表现出启动子活性。另外，与未处理的F383-I1比较，经过Sss I甲基化酶和5-AZA去甲基化药物处理的F383-I1的Firefly Lux／Renilla Luc比值明显降低和升高(p<0.05)。 　　3.人胃癌细胞株PDX1启动子CpG岛呈高度甲基化状态的MSP分析PDX1四个CpG岛在6株细胞(AGS、BCG823、SGC7901、MKN45、TMK1、SNU1)中均有完全甲基化或部分甲基化。 4.人胃癌细胞株CpG-I1甲基化状态的BSP分析6株人胃癌细胞(AGS、BCG823、SGC7901、MKN45、TMK1、SNU1)均表现出高度的的CpG-I1甲基化率(77.5％±4.4％、97.1％±1.9％、82.4％±5.9％、88.2％±5.3％、81.8％±2.8％、97.1％±1.3％)；而两例对照癌旁正常组织的CpG-I1甲基化率仅为1.9％±1.2％、1.0％±1.0％。 5.人胃癌组织CpG-I1甲基化MSP分析30例胃癌组织全部有CpG-I1甲基化(3例(10％)完全甲基化，27例(90％)部分甲基化)，而癌旁正常组织则有16例(53.33％)无甲基化，其余14例(46.67％)表现部分甲基化。 结论： 1.启动子CpG岛甲基化与PDXl基因在胃癌的表达下调相关； 2.去甲基化处理后PDX1基因在胃癌细胞中重新表达； 3.-2063～-1681nt 处的CpG-I1是PDX1启动子区域，有最强的启动子活性； 4.CpG-I1在人胃癌细胞和组织中呈现高度甲基化状态。