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目的:食管癌是常见消化道恶性肿瘤之一,亚洲东部为食管癌高发区。因其早期症状隐匿,患者在就诊时多为中晚期,失去根治性手术机会,化疗和放疗技术虽然有一定疗效,但中晚期患者预后无显著改善,且放化疗副反应明显。为此,干扰素抗肿瘤治疗作为一种新型治疗方法,获得疗效同时副反应轻,并且调节增强机体免疫力,从而成为恶性肿瘤治疗研究热点。多项研究证实,干扰素λ具有抗病毒、抗增殖及免疫调节等生物学作用,受体表达的组织特异性使其不会导致严重造血系统及神经系统副作用,因而有较广的临床应用前景。本研究的目的是建立IFN-λ基因真核表达系统,评估真核表达的IFN-λ的生物学作用;进而探索干扰素λ与化疗药物联用是否存在协同抑制作用,并探索细胞分子学机制,为IFN-λ在食管癌等恶性肿瘤新治疗中的临床应用提供理论依据及实验基础。方法:1 IFN-λ基因克隆及目的基因的表达:从poly I:C刺激的Hu H-7细胞m RNA中克隆IFN-λ基因全长,构建pc DNA3-IFN-λ载体,酶切鉴定后转染COS-7细胞,Western印迹检测IFN-λ基因的表达。2细胞增殖率检测:CCK-8法检测:以空白对照组的为100%,COS-7细胞表达的IFN-λ蛋白处理的食管癌YES5和T.Tn细胞株增殖率;IFN-λ1与CDDP及ADM联合处理的细胞株T.Tn和YES5的增殖率,Calcusyn软件处理数据。3 Western印迹检测:凋亡蛋白caspase-3在食管癌细胞株T.Tn和YES5(COS-7细胞表达的IFN-λ蛋白处理;IFN-λ1与CDDP或ADM联合处理)的表达。4实时荧光定量PCR检测:COS-7细胞表达的IFN-λ诱导食管癌YES5和T.Tn细胞株ISG15及Mx A抗病毒基因表达;IFN-λ1与CDDP联合处理食管癌T.Tn细胞株后,凋亡相关基因Cyto-C、ISG15、TRAIL表达和化疗敏感性相关基因survivin、ERCC1、BRCA1、Smac的表达。5应用SPSS16.0软件进行统计学分析,对各组数据进行正态性检验及方差齐性检验,数据资料用均数±标准误(x±SE)表示,方差齐的数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差不齐数据采用秩和检验,需比较的数据组以最小显著差法(Student-Newman-Keuls,SNK)作两两比较,每组实验不少于3个独立的重复样本,P<0.05为有显著性差异。结果:1成功构建IFN-λ基因真核表达体系克隆IFN-λ基因并构建pc DNA3-IFN-λ,经PCR、DNA测序和酶切鉴定,IFN-λ基因与Gen Bank公布的序列一致;经Western印迹条带提示IFN-λ蛋白在pc DNA3-IFN-λ转染的COS-7细胞中成功表达。2真核体系表达的IFN-λ生物学作用评估2.1真核体系表达的IFN-λ在食管癌细胞中的抗增殖作用应用上述真核细胞体系(pc DNA3-IFN-λ)表达的IFN-λ作用于人食管癌细胞株YES5和T.Tn,显示IFN-λ可明显抑制细胞增殖(空白对照组增殖率为100%;IFN-λ1处理组:YES5和T.Tn细胞增殖率分别为78.33%和59.75%;IFN-λ2处理组分别为72.92%和49.79%。),(P<0.05)。提示真核细胞体系表达的IFN-λ具有抗增殖作用。2.2真核细胞表达的IFN-λ诱导凋亡蛋白caspase-3活化Western印迹实验结果显示,真核细胞表达的IFN-λ1/2可显著诱导人食管癌YES5和T.Tn细胞中cleaved caspase3表达,提示真核细胞表达的IFN-λ可通过活化caspase3诱导肿瘤细胞凋亡。2.3真核细胞表达的IFN-λ上调抗病毒基因表达实时荧光定量PCR检测显示,真核细胞表达的IFN-λ作用于T.Tn和YES5细胞后,细胞ISG15和Mx A基因转录明显上调(P<0.05),提示真核细胞表达的IFN-λ可上调细胞抗病毒基因表达。3 IFN-λ与化疗药物联合应用的生物学效应及分子学机制3.1 IFN-λ与化疗药物联合应用的协同抗增殖作用以不同浓度的CDDP或ADM和不同浓度的IFN-λ1联合作用于食管癌细胞株T.Tn和YES5,Calcu Syn软件分析数据显示,IFN-λ和CDDP或ADM联合应用可产生协同抗增殖作用(CI<1)。提示IFN-λ与ADM或CDDP联合对细胞的增殖抑制活性较IFN-λ或化疗药单用时增强。3.2 IFN-λ与化疗药物联合应用诱导凋亡增加蛋白质印迹显示IFN-λ与ADM或CDDP联合作用于食管癌T.Tn细胞,较单药作用于细胞后cleaved caspase3的表达增加,提示IFN-λ与ADM或CDDP协同作用的机制是诱导肿瘤细胞凋亡增加。实时荧光定量PCR结果显示:联合应用后线粒体凋亡通路相关基因Cyto-C、死亡受体相关基因TRAIL及类泛素蛋白基因ISG15表达增加。3.3 IFN-λ诱导化疗药相关敏感基因表达有研究报道survivin、Smac、BRCA1和ERCC1的表达与CDDP敏感性及耐药相关,此次实时荧光定量PCR结果还显示:IFN-λ诱导凋亡抑制基因survivin表达增加和Smac表达无明显变化,诱导抑癌基因BRCA1表达增加,DNA修复基因ERCC1无明显变化。结论:1成功构建IFN-λ基因真核表达体系,体系表达的IFN-λ具有抗增殖、诱导凋亡及上调病毒分子表达的生物学作用。2 IFN-λ与化疗药物(ADM或CDDP)联合应用可显著增强对食管癌细胞的生长增殖抑制,两者具有协同作用;机制为诱导凋亡增加,线粒体通路和死亡受体通路激活增加相关,以及与IFN-λ诱导凋亡抑制基因Survivin表达下调并增加肿瘤细胞对化疗药CDDP的敏感性相关。