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丹参中次生代谢物酚酸类和丹参酮类成分的含量是评价丹参药材品质的重要指标,这两类物质的生物合成受到环境因子和遗传因素的双重影响。转录因子不但可以直接调控遗传基因的表达,还介导了环境因子对植物次生代谢物质合成的调控。因此,揭示转录因子在丹参次生代谢中的调控机制是丹参代谢工程研究的前提,也可以为阐明丹参药材品质形成机制奠定基础。本论文以毛状根为材料,对丹参5个bHLH家族转录因子调控酚酸类和丹参酮类物质的分子机制进行了研究,并阐述了SmbHLH7与SmMYB39两个转录因子对酚酸类物质代谢的协同调控机制。具体结果如下:1.我们从丹参转录组数据库中筛选到5个完整的bHLH家族转录因子,它们都包含了典型的HLH结构域,分别命名为:SmbHLH3、SmbHLH7、SmbHLH148、SmbHLH10和SmbHLH130。这几个转录因子基因在丹参植株六个不同部位(花、叶、茎、根皮、中柱、须根)均有表达,但是表达模式存在差异;同时,这几个转录因子基因不同程度的响应了MeJA、ABA和GA的诱导。亚细胞定位分析发现5个转录因子除SmbHLH10在细胞质中也有分布外,都位于细胞核中。2.分别获得了SmbHLH3、SmbHLH7、SmbHLH148、SmbHLH10和SmbHLH130的过表达毛状根,检测发现SmbHLH3负调控了三种酚酸(咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B)和四种丹参酮(隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅠⅠA)成分的代谢;SmbHLH7、SmbHLH148和SmbHLH130对酚酸类和丹参酮类物质的积累都是促进的作用;SmbHLH10对酚酸类成分代谢无显著调控作用,但促进了丹参酮类成分的生物合成。转基因毛状根中酚酸类和丹参酮类物质生物合成途径上的关键酶基因表达相对于野生型也发生了显著的变化。利用酵母单杂交实验发现SmbHLH3可以与酚酸类物质代谢途径上关键基因TAT和HPPR及丹参酮类物质代谢途径上关键基因KSL1和CYP76AH1启动子区的Gbox元件结合;SmbHLH7、SmbHLH148和SmbHLH130都可以结合到酚酸类物质代谢途径上C4H1、TAT、HPPR、CYP98A14和丹参酮类物质途径上DXS2、CPS1、CYP76AH1的启动子区;此外,SmbHLH148还可以结合到PAL1启动子上的G-box,SmbHLH7和SmbHLH130还可以结合到KSL1基因启动子区,但SmbHLH130与KSL1及CYP76AH1基因上的G-box结合较弱;SmbHLH10可与CPS1、CPS5及DXS2的启动子序列互作。3.前期我们研究发现了一个负调控酚酸类物质代谢的R2R3 MYB转录因子:SmMYB39,鉴于植物中bHLH转录因子通常会与MYB蛋白互作形成复合体调控次生代谢进行,我们利用酵母双杂交的方式对5个SmbHLH进行了筛选。结果显示,SmbHLH7和SmbHLH130都可以与SmMYB39互作,但是包含pGBKT7-SmbHLH130与pGADT7-SmMYB39的酵母菌株生长较弱。对SmbHLH7和SmMYB39蛋白序列分析发现其互作区域可能位于各自N端,蛋白截短实验验证了这一猜测。4.分别获得了SmMYB39过表达和RNAi干扰的转基因毛状根,发现SmMYB39还负调控了丹参酮类成分的积累。SmbHLH7的RNAi沉默毛状根中酚酸类和丹参酮类物质的含量相对于对照都显著减少。分析发现SmMYB39和SmbHLH7调控酚酸类和丹参酮类物质代谢的基因具有重叠。将SmbHLH7和SmMYB39共表达发现SmMYB39的表达量可以提高到对照的几百倍,而SmbHLH7的表达只提高了近10倍。在过表达SmbHLH7的同时将SmMYB39沉默后酚酸类和丹参酮物质的代谢得到促进,而且促进效果要高于单独过表达SmbHLH7或单独沉默SmMYB39。SmMYB39的过表达会抑制SmbHLH7的转录,沉默SmMYB39后SmbHLH7的表达得到提高;而过表达SmbHLH7会促进SmMYB39的转录,沉默SmbHLH7后SmMYB39的转录受到抑制。说明两个转录因子之间除在蛋白层面有相互调节之外,在转录层面也可以直接互相调控。本文通过对丹参转录组数据分析,筛选出5个参与酚酸类或丹参酮类物质生物合成调控的SmbHLH基因,利用毛状根转基因技术对其功能进行了解析,并对这几个转录因子的靶基因进行了鉴定。还发现SmbHLH7与负调控因子SmMYB39对丹参活性成分代谢协同调控机制有三个层面:SmMYB39与SmbHLH7竞争性的结合酚酸或丹参酮代谢途径关键基因;负调控因子SmMYB39直接抑制SmbHLH7转录;SmMYB39与其他正调控的MYB竞争性结合SmbHLH7,使得正调控MBW复合体无法形成。