第一部分 兔VX2瘤脑脊液源性转移模型的建立及MRI表现与病理对照研究目的： ①建立肿瘤脑脊液源性转移的动物模型；②分析脑脊液源性转移动物模型的MRI表现及病理特征，阐述MRI诊断脑脊液源性转移的标准。材料和方法： 实验动物随机分两组，实验组(VX2瘤细胞组)：24只，抽取0.2ml浓度为10~5／ml的VX2瘤细胞悬液经枕大池注入蛛网膜下腔。对照组(生理盐水组)：6只，抽取0.2ml生理盐水注入蛛网膜下腔。实验兔术后不同时间行MRI检查。使用GE公司的SIGNA 1.5T磁共振成像系统，膝关节正交线圈。先行常规各种平扫及耳缘静脉注入0.1 mmol／kg造影剂增强扫描以后，再次注入0.2 mmol／kg造影剂，即时及延迟20分钟后再行脂肪抑制TlWI扫描，扫描参数为SET1WI(TR／TE 350ms／15ms)，FSE T2WI(TR／TE 3000ms／90ms)，脂肪抑制TIWI(TR／TE 400ms／12ms)及FLAIR(TR／TE／TI 8800／127.5／2200)。观察指标：动物实验发现脑脊液源性转移难以区分结节型、线型及混合型，所以我们只以阳性征象计算。观察病灶的数目，进行病变部位增强效果的分析。实验兔每次MRI检查后处死，相应病理标本进行大体观察，行HE及VEGF免疫组织化学染色，光镜下观察。 结果： 1 MRI表现： 1)MRI平扫表现：①实验组：15天及21天各1只、27天2只蛛网膜下腔或脑脊髓实质内T1wI发现结节状低信号，T2WI呈等低信号(相对于脑脊髓实质)，主要分布于枕骨大孔附近及后颅窝颅底部，直径平均5.8±2.3mm。20只常规T1WI和T2WI平扫MRI未见异常。FLAIR可见病灶呈略高信号，脑脊液呈明显低信号，增厚脑膜呈波浪状或结节状，12只实验兔呈阳性表现。②对照组：6只实验兔MRI均呈阴性表现。 2)MRI增强表现：①实验组：3天扫描时的实验兔均未见异常征象。此后不同时间扫描18只实验兔发现脑脊膜和／或蛛网膜下腔呈线样不规则增厚，或线样和结节状混合存在，以后者多见，部分邻近脑脊髓实质内可见结节状病灶信号，并见不同程度强化。20只平扫MRI未见异常的实验兔，增强后15只发现脑脊膜转移灶，其中5只脑脊髓内亦发现病灶。2只颅内及椎管内仍未见异常，其中一只可见穿刺部位颈部肌肉内有肿瘤增强病灶。FLAIR增强发现18／22只实验兔呈阳性征象。FLAIR和FLAIR增强的平均病灶脑组织对比信噪比分别为6.35±2.55和11.51±3.05。常规量强化扫描发现动物模型阳性数为15／22只，而三倍量造影剂注射后强化扫描发现为21／22只。②对照组：5／6只实验兔MRI均呈阴性表现，1只穿刺部位6及9天时可见穿刺部位脑膜轻度线状强化，以后未见明显异常改变。2病理特征 1)大体：实验组3天未见明显异常改变，6天后可发现受累脑脊膜增厚，色暗红，表面粗糟，与脊髓及脑实质粘连，部分局部可见大小不等的结节形成。脑脊膜及脑脊髓内肿瘤结节边界清晰，较大者周围见增生血管包绕，切开后为实性，色白呈鱼肉状。对照组未见明显异常改变。 2)镜下：实验组3天蛛网膜下腔内可见多量肿瘤细胞沿软脑膜及蛛网膜浸润，6天以后可见肿瘤细胞在蛛网膜下腔内增殖，部分肿瘤病变不同程度侵入脑及脊髓内，肿瘤细胞呈条索状、巢样排列，核大深染，有明显异形性，可见异常核分裂像，其间有结缔组织分隔，肿瘤组织与周围结构分界欠清晰，其内可见较多小血管形成，并见炎性细胞浸润，肿瘤结节坏死区为无结构成分。对照组未见明显异常改变。 3统计学结果 1)两组脑脊液转移模型成瘤率比较：经X~2检验，实验组与对照组间有统计学意义(X~2=7.89，P＜0.01)。 2)MRI平扫与增强后阳性征象率比较：经X~2检验，两者间有统计学意义(X~2=6.28，P＜0.01)。 3)FLAIR增强和单纯FLARI两种成像序列的病灶脑组织对比信噪比有显著性差异(t=5.28，P＜0.01)。FLAIR增强序列发现的病灶数较单纯FLAIR序列增加约50％，较常规量增强T1WI增加约20％。 4)同一病灶或病灶部位，随着注射对比剂剂量的增大和适当的延时(本研究为20分钟)相对信噪比(C／N)有增加的趋势，Gd 0.3mmol／kg和Gd 0.1mmol／kg增强扫描相比病灶的相对信噪比有显著性差异(t=12.35，P＜0.05)。注射对比剂后即时扫描与延迟20分钟扫描之间信噪比亦有显著性差异。三倍剂量的MR检查发现的阳性模型数数较常规剂量增加约40％。 结论 1．成功建立了肿瘤脑脊液源性转移的动物模型。实验组总的脑膜成瘤率为90.91％，与对照组间存在统计学意义。 2．MRI增强扫描是影像学早期发现脑膜病变的首选方法。MRI增强较平扫显示的阳性征象率有明显提高，两者比较有统计学意义。大剂量造影剂(Gd-DTPA)MR强化扫描及延迟MR强化扫描可增加相对信噪比和病灶的检出率，三倍剂量较常规剂量可多发现40％的病灶。FLAIR增强扫描较常规量TIWI增强扫描和单纯FLAIR扫描的相对信噪比和病灶检出率都要高，但不如三倍量TIWI增强扫描。 第二部分 MRI监测兔VX2瘤脑脊液源性转移的生物学行为 与VEGF表达的相关性研究 目的 ①分析脑脊液源性转移动物模型中脑脊液、血液及肿瘤组织中VEGF的表达及其变化规律；②动态MRI活体连续监测动物模型肿瘤的变化，分析DCE-MRI参数与肿瘤VEGF表达水平的相关性；探讨DCE-MRI在肿瘤生物学成像中的价值。 材料和方法 将30只新西兰大白兔分两组。A：实验组共24只，蛛网膜下腔接种VX2瘤细胞后3、6、9、12、15、21、27、33天行MRI及DCE-MRI检查，计算参数MER(最大强化率)和SLE(强化率斜率)值。B：对照组共6只，蛛网膜下腔注入生理盐水后与实验组相同时间及参数各扫描一次。每次MRI检查前，分别抽取实验兔的脑脊液和血液样品做VEGF的酶联免疫吸附法(ELISA)测定。每次MRI扫描后处死所扫描实验兔，获取病理标本，行HE染色及VEGF免疫组化染色。 免疫组化VEGF表达结果判断标准采用IHS法半定量分析。 结果 1．DCE-MRI检查：在肿瘤免疫组化VEGF高表达组中，MER和SLE数值分别为1.776±0.152和0.0585±0.0105，而在低表达组中，MER和SLE数值分别为1.356±0.085和0.0388±0.0057，经t检验，SLE在VEGF表达分组中有显著统计学差异(P＜0.01)，MER亦有统计学差异(P＜0.05)。VX2瘤细胞植入后15天，SLE值最高，为0.0585±0.0105，而3天时最低为0.0276±0.048，经t检验，两者有统计学意义(P＜0.01)。 2．VEGF表达检测：实验组免疫组化在肿瘤细胞的细胞浆和细胞膜以及部分细胞核中均可见VEGF阳性颗粒，对照组呈阴性。血清中及脑脊液中的VEGF均呈高表达，VX2瘤细胞植入后15天，血清中的VEGF水平最高，为55.2±8.5(pg／ml)，而3天时最低为31.5±4.3(pg／ml)，经t检验，两者有统计学意义(P＜0.01)；对照组为11.7±3.5，经t检验，实验组分别与对照组比较有统计学意义(p＜0.01)。血清中的VEGF表达要高于脑脊液，两者比较有统计学意义(p＜0.05)。 3．DCE-MRI参数与VEGF表达的相关性分析：经Spearman’s等级相关法分析，SLE与肿瘤组织免疫组化VEGF表达呈正相关(P＜0.01)，而MER与肿瘤组织免疫组化VEGF表达呈负相关(P＜0.05)。经Spearman’s等级相关法分析，血液中的VEGF表达与脑脊液中的VEGF表达具有相关性(P＜0.01)。SLE与血清中的VEGF表达呈正相关(P＜0.01)；SLE和脑脊液中的VEGF表达呈正相关(P＜0.01) 结论 1．在脑脊液源性转移中，肿瘤组织免疫组化以及血液、脑脊液ELISA检测VEGF均呈高表达，因此我们推测脑脊液源性转移也与VEGF调节下的肿瘤血管生成密切相关。 2．DCE-MRI参数尤其是SLE与脑脊液源性脑脊膜转移的VEGF表达程度之间存在显著的相关性，其病理学基础是VEGF促进脑脊膜转移肿瘤的血管生成及增加血管的通透性。 3．通过DCE-MRI T1WI成像方法，可有效地监测肿瘤的VEGF表达水平，可以在一定程度上反映脑脊液源性转移血管通透性和新生肿瘤血管的生成，为评价脑脊液源性转移是否采用抗血管治疗及判定治疗效果提供可靠的影像学检测手段。 第三部分 VEGF反义核酸对兔VX2瘤脑脊液源性转移生物学行为调控的MRI监测 目的 ①构建兔VEGF反义cDNA真核表达载体(pcDNA3．1-ASVEGF)：②利用反义核酸技术调控脑脊液源性转移的形成，MRI活体动态监测，探讨抗血管生成治疗在脑脊液源性转移形成和预后中的价值。 材料和方法 1．兔VEGF反义核酸真核表达质粒的构建： 用Trizol法从兔子肾脏组织内提取组织总RNA，通过RT-PCR扩增及克隆VEGF cDNA。测序验证后，将VEGF cDNA插入真核表达质粒pcDNA3.1中，应用限制性内切酶NcoⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定是否正向或反向克隆至pcDNA3.1载体中，挑取含预期条带的克隆测序验证，最终获得兔子VEGF反义cDNA真核表达质粒(pcDNA3.1-ASVEGF) 2．MRI监测 50只新西兰大白兔，分5组，每组10只：A．治疗1组(VX2细胞+150μgpcDNA3.1-ASVEGF+脂质体)；B．治疗2组(于植入肿瘤细胞第6天时鞘内注入150μg pcDNA3.1-ASVEGF+脂质体)；C．治疗3组(于植入肿瘤细胞第6天时鞘内注入300μg pcDNA3．1-ASVEGF+脂质体)；D．对照1组(单纯注射VX2细胞)；E．对照2组(VX2细胞+脂质体)。VX2细胞接种后不同时间行MRI检查。使用GE公司的SIGNA 1.5T磁共振成像系统，膝关节正交线圈。行常规及DCE-MRI检查，分析时间-信号曲线参数SLE值。在每次MR检查前抽取实验兔血液和脑脊液标本做VEGF的ELISA检测。所有实验兔在最后一次检查完毕后取材行病理检查和VEGF免疫组化染色分析。 结果 1．经酶切及测序鉴定，成功获得兔子反义VEGF核酸真核表达载体(pcDNA3.1-ASVEGF)。 2．DCE-MRI参数SLE分析：VX2瘤细胞植入后6天，A组SLE为0.0192±0.0076，B组0.0365±0.0104，C组为0.0338±0.0112，D组为0.0342±0.012，E组为0.0354±0.0098，A组低于B、C、D、E各组，有统计学意义(P＜0.01)。植入后9天，A组SLE为0.0269±0.0084，B组0.0234±0.0095，C组为0.0236±0.0057，D组为0.0587±0.0185，E组为0.0532±0.0167，A、B、C组SLE均低于D、E组，有统计学意义(P＜0.01)。植入后21天，各组SLE间无统计学意义(P＞0.05)。 3．脑脊液转移结节病灶大小：6天时，A组瘤灶直径为0mm，B组为4.0mm，C组为3.5±1.0mm，D组为4.2±1.3mm，E组为4.3±1.1mm。经ANOVA检验，A组瘤灶直径与其它各组间有统计学意义(P＜0.01)。21天时，A组瘤灶直径为5.2，B组为5.9±1.9mm，C组为6.0±1.8mm，D组为8.5±2.5mm，E组为8.8±2.6mm。经ANOVA检验，实验组(A、B、C组)瘤灶直径与对照组(D、E组)间有统计学意义(P＜0.01)，两对照组问无统计学意义(P＞0.05)。 4．肿瘤生长速度：经ANOVA检验，VX2瘤细胞植入6天，A组肿瘤大小与B、C、D、E组相比有统计学意义(P＜0.05)：B、C、D、E组间无统计学意义(P＞0.05)。VX2瘤细胞植入15天，A组肿瘤大小与B、C、D、E组有统计学意义(P＜0.05)：B、C组肿瘤大小与D、E组分别有统计学意义(P＜0.05)：B、C组间以及D、E组间无统计学意义(P＞0.05)。VX2瘤细胞植入27天，A、B、C组间无统计学意义(P＞0.05)。 5．动物存活时间：A组平均28±6d；B组平均27±7d；C组平均26±7d；D组平均20_+5d；E组平均19±5d。经ANOVA检验，实验组与对照组间有统计学意义(P＜0.01)，两对照组间无统计学意义(P＞0.05)。 6．VEGF表达： ①VEGF免疫组化结果：IHS平分结果为：A组平均为3.3±0.82，B组为3.83±1.33，C组为3.50±1.38，D组8.83±1.94，E组9.2±2.4，实验组IHS评分与对照组均存在统计学意义(P＜0.01)。实验组组间以及对照组组间无统计学意义(P＞0.05)，DCE-MRI参数SLE与VEGF的IHS评分呈正相关(P＜0.05)。 ②脑脊液及血液ELISA法VEGF检测结果：经ANOVA检验，实验组与对照组间有统计学意义(P＜0.05)，两对照组间无统计学意义(P＞0.05)。DCE-MRI参数SLE与血液及脑脊液VEGF表达均呈正相关(P＜0.05)。 结论 1．成功构建兔VEGF反义cDNA真核表达载体(pcDNA3.1-ASVEGF)。 2．VEGF反义核酸可在分子水平上有效抑制VEGF表达。VEGF反义核酸对脑脊液源性转移瘤具有调控作用。 3．MRI是一种可靠、无创的脑脊液源性转移病变反义核酸治疗监测工具。