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鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer,RA）是严重危害鸭、鹅等禽类健康的重要病原,长期使用抗菌药物进行防治,带来了耐药性增加等防治及公共卫生问题。耐药节结化细胞分化（Resistance nodulation division,RND）家族外排泵的表达是造成细菌多重耐药重要原因之一,围绕RA的基因组是否编码具有RND外排泵、是怎样介导RA耐药等科学问题开展系列试验研究,主要研究内容和结果如下:1鸭疫里默氏菌B7390873介导RA氨基糖苷类和去污剂类化合物耐药对本实验室完成测序的RA-CH-1株的基因组进行生物信息学分析,结果发现B7390781、B7390873和B7391785三个基因的编码蛋白具有11-12个跨膜区（TM D）,在TMD 1-2和TMD 6-7之间分别有一个小大约300 aa的周质环,且三个蛋白都位于细胞质膜,他们的相邻基因中,B7390782、B7390872和B7391783编码膜融合蛋白,B7390780、B7390871和B7391784编码外膜通道蛋白。对成功构建的缺失株（RA-CH-1ΔB7390873）和回补株（RA-CH-1ΔB7390873 pLMF03::B7390873）的测定结果表明:（1）缺失株和回补株的生长速度与亲本株没有明显差异,亲本株和缺失株的竞争指数（CI）在0.98-1.08之间;（2）与亲本株相较,链霉素、庆大霉素、卡那霉素、十二烷基硫酸钠（SDS）和Triton X-100对缺失株的最小抑菌浓度（MIC）分别从128、32、256、640和160μg/mL降为16、2、32、40和40μg/mL（即敏感性升高4-16倍）,对回补株的MIC值可恢复至亲本株的水平;（3）亲本株和缺失株对1日龄雏鸭的半数致死量(LD50)相近,分别为5.62×107 CFU/mL和6.14×107 CFU/mL。因此,B7390781、B7390873和B7391785有典型的R ND外排泵蛋白的基本结构特性;B7390873的缺失不影响RA的生长和毒力,B7390873具有介导RA耐氨基糖苷类抗生素和去污剂类化合物的功能。2鸭疫里默氏菌B7390873工作能量来源的研究培养基中加入RND外排泵能量抑制剂1μg/mL CCCP后的MIC检测结果显示,链霉素、庆大霉素、卡那霉素、SDS和Triton X-100对亲本株和回补株的MIC值都下降至缺失株的水平（MIC值都分别从128、32、256、640和160μg/mL降为16、2、32、40和40μg/mL）,而对缺失株的MIC值没有发生改变。进一步应用庆大霉素ELISA检测试剂盒对亲本株、缺失株和回补株摄入庆大霉素含量进行检测,结果显示,24 min摄取达饱和状态,此时缺失株、亲本株和回补株的庆大霉素含量分别为86.7、13和14.2 pmol/mg;24 min加入CCCP后继续培养,至56 min达到饱和,亲本株和回补株摄入庆大霉素含量继续积累增加,含量分别达到61.6和54.5pmol/mg,而缺失株含量没有显著变化（82.9 pmol/mg）,说明CCCP能抑制亲本株和回补株中B7390873外排庆大霉素的活性。因此,B7390873是由PMF提供能量的外排泵。3鸭疫里默氏菌B7390873蛋白必需氨基酸位点的研究针对B7390873中的第400、401、929、959和966位氨基酸构建了5个点突变株（RA-CH-1ΔB7390873 pD400A、RA-CH-1ΔB7390873 pD401A、RA-CH-1ΔB7390873 pK929E、RA-CH-1ΔB7390873 pR959A和RA-CH-1ΔB7390873 pT966A）。氨基糖苷类抗生素和去污剂类化合物对5株点突变株的MIC检测结果表明,链霉素、庆大霉素、卡那霉素、十二烷基硫酸钠和Triton X-100的MIC值分别为16、2、32、40和40μg/mL。利用制备的兔抗B7390873截段蛋白多克隆抗体进行western-blot证实5个点突回补株均能够正确表达B7390873蛋白。说明D400、D401、K929、R959和T966是B7390873外排泵外排氨基糖苷类抗生素和去污剂类化合物的必需的5个氨基酸位点。4鸭疫里默氏菌B7390873的功能需要B7390872的参与以RA-CH-1株的cDNA为模板进行PCR扩增,结果表明B7390872和B7390873共转录;MIC检测结果表明,氨基糖苷类抗生素和去污剂类化合物对单缺失株（RA-CH-1ΔB7390873）、双缺失株（RA-CH-1ΔB7390872ΔB7390873）和双缺失株回补株（RA-CH-1ΔB7390872ΔB7390873 pLMF03::B7390873）的MIC值无差异;说明B7390872也参与了RA-CH-1株对氨基糖苷类抗生素和去污剂类化合物耐药的过程。构建E.coli的重组表达菌株JP313 pBAD24::B7390872、JP313 pBAD24::B7390873和JP313 pBAD24::B7390872-B7390873,用化学交联剂DSP对阿拉伯糖诱导表达后各重组表达菌中的蛋白进行化学交联,western-blot结果显示JP313 pBAD24::B7390872-B7390873表达产物中150 kDa的蛋白是B7390872和B7390873的复合体蛋白,说明B7390872和B7390873之间发生了相互作用。5鸭疫里默氏菌B7390870对B7390873调节作用的研究基因组中B7390870位于B7390873的上游相邻位置,生物信息学分析显示B7390870编码TetR转录调节蛋白。以RA-CH-1株的cDNA为模板,PCR扩增结果表明B7390870、B7390871和B7390872共转录。构建B7390870过表达株（RA-CH-1 pLMF03::B7390870）,RT-PCR结果显示过表达株中B7390871、B7390872和B7390873的mRNA水平都较亲本株下降约5倍左右。MIC检测结果显示链霉素、庆大霉素、卡那霉素、SDS和Triton X-100对过表达株的MIC值（与亲本株相比,敏感性升高2-4倍）分别为32、8、64、160和80μg/mL。说明B7390870对B7390873发挥外排氨基糖类苷抗生素和去污剂类化合物的功能具有抑制作用。综上,B7390873基因编码一个介导RA对氨基糖苷类抗生素和去污剂类化合物耐药的RND外排泵,表明RND外排泵的表达是RA的耐药机制之一。