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第一部分TIPE2过表达基因修饰对h AMSCs的增殖、迁移及免疫抑制相关因子分泌能力的影响目的:探讨肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8样-2（tumor necrosis factor-α-induced protein-8like-2,TIPE2）过表达基因修饰对人羊膜间充质干细胞（human amnion-derived mesenchymal stem cells,h AMSCs）的增殖、迁移及免疫抑制相关因子分泌能力的影响,为TIPE2过表达h AMSCs的同种异体小鼠心脏移植模型体内应用提供实验基础。方法:（1）显微镜观察、流式细胞术及免疫荧光鉴定h AMSCs;（2）流式细胞术选出最佳感染复数（multiplicity of infection,MOI）,倒置荧光显微镜观察病毒转染情况,蛋白质免疫印迹法（western blot,WB）验证TIPE2的过表达;（3）连续6天采用CCK-8法检测未转染h AMSCs（h AMSCs）、携带GFP的空载腺病毒转染的h AMSCs（GFP-h AMSCs）以及TIPE2过表达的h AMSCs（TIPE2-h AMSCs）的增殖活力并绘制曲线,Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力;（4）对三种细胞分别采用正常培养基或添加了干扰素-γ（10ng/ml）、肿瘤坏死因子-α（10ng/ml）的炎性诱导培养基培养48h后,实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和酶联吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）检测吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）、转化生长因子-β（transforming growth factorβ,TGF-β）和白介素10（interleukin-10,IL-10）的基因表达水平及分泌水平。结果:（1）h AMSCs呈梭型,旋涡状贴壁生长,CD73、CD90呈高表达,几乎不表达CD11b、CD34和CD45,免疫荧光显示波形蛋白高表达,符合间充质干细胞特征。（2）h AMSCs的腺病毒转染适宜MOI值为180,转染后荧光显微镜下观察GFP-h AMSCs与TIPE2-h AMSCs均可见较强的绿色荧光,h AMSCs未见绿色荧光表达;WB结果显示,与hAMSCs和GFP-hAMSCs相比,TIPE2-hAMSCs的TIPE2蛋白水平明显增高（p＜0.05）。（3）增殖活力曲线显示,与h AMSCs相比,GFP-h AMSCs与TIPE2-h AMSCs的增殖能力从第3日开始下降（P＜0.05）,而TIPE2-h AMSCs与GFP-h AMSCs之间的增殖能力无明显差异;Transwell迁移实验显示,与h AMSCs及GFP-h AMSCs相比,TIPE2-h AMSCs的迁移能力显著提高（p＜0.05）。（4）q RT-PCR结果显示,不论使用正常培养基还是使用炎性诱导培养基培养,与GFP-h AMSCs相比,TIPE2-h AMSCs的IDO与IL-10的基因表达水平均有所提高（p＜0.05）;ELISA结果显示,使用正常培养基培养时,TIPE2-h AMSCs培养基中的IDO水平与GFP-h AMSCs相比显著提高（p＜0.05）,使用炎性诱导培养基培养时,与GFP-h AMSCs相比TIPE2-h AMSCs培养基中的IDO及IL-10的水平明显提高（p＜0.05）。结论:（1）使用腺病毒转染成功构建了空载h AMSCs及TIPE2过表达h AMSCs。（2）TIPE2过表达不会明显抑制h AMSCs的增殖活性,且能提高h AMSCs的细胞迁移能力与免疫抑制相关因子的分泌能力。第二部分TIPE2过表达对h AMSCs在心脏移植小鼠免疫耐受诱导效果的影响及相关机制初探目的:探讨TIPE2过表达对h AMSCs在小鼠同种异体心脏移植模型中的免疫耐受诱导作用的影响,并对其影响机制进行初步探索。方法:（1）以C57BL/6为供体,Balb/c为受体建立小鼠颈部心脏移植模型,按随机数字表法分为对照组Control组、GFP-h AMSCs组、TIPE2-h AMSCs组,每组模型鼠各12只,分别在模型建立后第1、4天腹腔注射PBS（0.2ml）、GFP-h AMSCs悬液（5×10~5个/0.2ml）、TIPE2-h AMSCs悬液（5×10~5个/0.2ml）;（2）向心脏移植模型小鼠腹腔内注射DIL荧光探针标记的GFP-h AMSCs与TIPE2-h AMSCs,在注射后第3天小动物活体成像观察DIL荧光在模型鼠中的分布情况;（3）记录各组移植心脏存活时长并绘制生存曲线;（4）在术后第7天回收小鼠的移植心脏、外周血、脾脏,分别进行以下检测:a.制作心脏苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin,H＆E）切片观察移植心脏病理学改变;b.ELISA检测小鼠血清中IL-10、TGF-β水平;c.流式细胞术检测小鼠外周血及脾脏中辅助性T细胞（T helper cells,Th）Th1、Th2、Th17及调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）在CD4+T细胞中的占比,并计算Th1/Th2、Th17/Treg比值;d.WB检测移植心脏组织中p38、p-p38的表达情况,进一步探索TIPE2-h AMSCs减轻心脏移植排斥反应可能的信号通路。结果:（1）小动物活体成像显示,腹腔注射的GFP-h AMSCs和TIPE2-h AMSCs的体内分布情况相似,解剖后对各个脏器进行观察后发现两种细胞在腹腔注射后第3天均可归巢于移植心脏。（2）与Control组相比,GFP-h AMSCs组移植心脏存活时长明显延长（p＜0.05）,而TIPE2-h AMSCs组与GFP-h AMSCs组相比进一步延长（p＜0.05）。（3）H＆E染色切片可见Control组移植心脏组织中心肌细胞坏死断裂,心肌结构紊乱,同时伴有大量炎性细胞浸润与心肌间质出血水肿;与Control组相比,GFP-h AMSCs组的炎性细胞浸润程度、心肌间质水肿出血以及心肌细胞坏死情况均有所减轻。TIPE2-h AMSCs组的心肌间质可见少量炎性细胞浸润,心肌结构紊乱与间质出血情况较GFP-h AMSCs组明显改善。（4）ELISA结果显示,GFP-h AMSCs组小鼠血清中IL-10以及TGF-β水平明显高于Control组（p＜0.05）;与GFP-h AMSCs组相比,TIPE2-h AMSCs组小鼠血清中IL-10以及TGF-β水平显著升高（p＜0.05）。（5）脾细胞流式结果显示,与Control组相比,GFP-h AMSCs组的脾淋巴细胞中的Th1、Th17细胞比例显著降低（p＜0.05,p＜0.05）,Treg细胞比例显著升高（p＜0.05）,脾淋巴细胞的Th1/Th2与Th17/Treg比值显著降低（p＜0.05,p＜0.05）;与GFP-h AMSCs组相比,TIPE2-h AMSCs可显著上调小鼠脾Th2比例（p＜0.05）,下调脾脏中的Th1/Th2与Th17/Treg比值（p＜0.05,p＜0.05）,诱导脾淋巴细胞Th1/Th2平衡向Th2偏移、Th17/Treg平衡向Treg偏移;外周血细胞流式结果显示,与Control组相比,GFP-h AMSCs组的外周血淋巴细胞中的Th1细胞比例显著降低（p＜0.05）,Th2、Treg细胞比例显著升高（p＜0.05,p＜0.05）,外周血淋巴细胞的Th1/Th2与Th17/Treg比值显著降低（p＜0.05,p＜0.05）;与GFP-h AMSCs组相比,TIPE2-h AMSCs可显著下调小鼠外周血淋巴细胞中Th1与Th17细胞比例（p＜0.05,p＜0.05）,上调小鼠外周血Th2与Treg细胞比例（p＜0.05,p＜0.05）,下调外周血淋巴细胞中的Th1/Th2比值（p＜0.05）,诱导外周血淋巴细胞Th1/Th2平衡向Th2偏移。结论:（1）腹腔注射的h AMSCs同样可归巢至远在颈部的移植心脏处;（2）h AMSCs可延长移植心脏存活时长并减轻排斥反应损伤程度,上调血清中免疫抑制相关因子水平,通过调节外周血及脾脏中CD4+T细胞各亚群比例诱导免疫耐受的形成,而TIPE2过表达可进一步加强h AMSCs的免疫耐受诱导效果,机制可能与对心脏组织中p38磷酸化的抑制有关。