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本研究旨在探讨SIRT1/AMPKα信号通路在高脂血症奶牛脂质代谢紊乱中的作用机制,为阐明奶牛高脂血症发病机制和寻找治疗靶点提供理论依据。颈静脉采集奶牛血液,分离血清,经检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量后选取12头奶牛,分为对照组和高脂组,每组6只。常规方法处死奶牛后无菌状态下采集肾脏周围脂肪组织样品。采用全自动生化分析仪检测血清葡萄糖、肝脏功能等生化指标、检测血清和脂肪组织脂质代谢指标TG、TC等含量变化。HE染色和油红O染色观察脂肪组织病理变化和脂质积累。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清非脂化脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHBA)含量。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测脂质代谢及SIRT1/AMPKα信号通路相关基因的相对表达量。Western blotting检测SIRT1/AMPKα信号通路中关键蛋白及脂代谢重要蛋白SREBP-1c、PPARγ2等的表达水平。无菌分离培养新生犊牛脂肪细胞,观察原代及分化过程中奶牛脂肪细胞形态学变化,检测脂肪细胞分化过程中TG含量和PPARγ2、SREBP-1c mRNA相对表达量。CCK8法确定NEFA和BHBA的最佳作用时间,分化成熟后添加不同浓度(0、0.6、1.2、2.4 mM)的NEFA或BHBA溶液在最佳作用时间点收集细胞。采用全自动生化分析仪检测NEFA或BHBA对脂肪细胞脂代谢指标的影响,采用qRT-PCR和Western blotting法检测NEFA、BHBA对脂肪细胞SIRT1/AMPKα信号通路及脂代谢相关基因、蛋白质SREBP-1c、PPARγ2等表达水平的影响,ELISA法检测NEFA和BHBA对脂肪细胞中ATP和AMP含量及AMPKα2酶活性的影响。结果:1.与对照组相比,高脂组奶牛血清Insulin水平显著降低(P<0.05),NEFA和BHBA水平显著升高(P<0.05),脂肪组织中脂代谢指标TC、TG水平显著升高(P<0.05)。2.HE染色可见高脂组细胞肿胀,体积变大,部分细胞脂滴增多。油红O染色可见高脂组脂滴相互融合形成空泡状脂肪细胞,细胞边界模糊,细胞轮廓不清,体积变大。3.与对照组相比,高脂组奶牛脂肪组织SIRT1/AMPKα通路关键基因SIRT1、LKB1 mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。脂合成关键酶基因ACSL的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),脂合成调控关键酶基因SREBP-1c、PPARγ2的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),脂肪分解关键酶基因ACO的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。蛋白质表达情况检测结果表明:与对照组相比,高脂组p-LKB1/LKB1及p-AMPKα2/AMPKα2的比例显著降低(P<0.05),脂质氧化蛋白CPT1的表达量极显著降低(P<0.01),脂质氧化和分解蛋白ACO、HSL表达量显著降低(P<0.05),脂合成蛋白FAS的表达量显著升高(P<0.05)。脂质调控蛋白PPARy和SREBP-1c的表达量显著升高(P<0.05)。4.原代培养的脂肪细胞经诱导分化成熟后,CCK8法确定NEFA、BHBA的最佳作用时间分别为12h、9h。与对照组相比,1.2、2.4mMNEFA处理组和1.2、2.4mM BHBA处理组TC、TG含量均显著升高(P<0.05)。5.AMPKα2、LKB1、SIRT1 mRNA相对表达量随着NEFA和BHBA浓度的增加显著降低(P<0.05),添加AICAR时三者表达量增加;脂合成基因ACCα、FAS的mRNA相对表达量在2.4 mM处理组显著升高(P<0.05),添加AICAR时表达量下降(P>0.05);脂分解基因HSL和CPT1的mRNA相对表达量在2.4 mM处理组显著降低(P<0.05),添加 AICAR 时表达量增加(P>0.05);PPARy2 mRNA 和 SREBP-1c的mRNA相对表达量在1.2、2.4 mM处理组显著增加(P<0.05),添加AICAR时表达量降低(P>0.05)。蛋白质表达情况检测结果表明:AMPKα2、LKB1、SIRT1蛋白表达量随着NEFA和BHBA浓度的增加在2.4 mM处理组显著降低(P<0.05),添加AICAR时三者表达量增加,PPARγ2和SREBP-1c蛋白表达量随着NEFA和BHBA浓度的增加在1.2、2.4 mM处理组显著增加(P<0.05),添加AICAR时二者表达量降低(P>0.05)。6.脂肪细胞内AMP含量在1.2和2.4 mM处理组显著降低(P<0.05),AICAR处理组高于对照组(P>0.05);ATP表达趋势与之相反,AMP/ATP比值在1.2、2.4 mM组均显著低于对照组(P<0.05),说明AMPKα活性显著降低(P<0.05)。结论:高脂血症奶牛脂肪存在脂代谢紊乱,通过抑制SIRT1/AMPKα信号通路对奶牛脂代谢进行调控,促进脂质合成、抑制脂质氧化,进一步造成脂质的沉积。