论文部分内容阅读
胃癌因其发病率第四,死亡率第二,而逐渐成为全球性的健康威胁,且以不受控制的细胞增殖、侵袭和转移为主要临床特点,再加上确诊时多是在中晚期,因此,大多数胃癌患者是死于转移性癌症,而非原发性癌症。胃癌的临床治疗以细胞毒药物为主(铂类和尿嘧啶类),这就造成了药物单一、毒副作用大、继发耐药、效果不理想的临床现状。而且,针对胃癌转移领域的研究相对滞后,目前尚无特效的抗转移药物。因此,有效药物的发现与开发、更多的新药投入临床使用极为重要且迫在眉睫,寻找一种具有抑制胃癌侵袭、迁移、增殖的新型治疗药物已成为胃癌研究的重点及热点。天然产物及其代谢物因具有结构新颖、活性独特、多个靶点等特点,在抗肿瘤药物研究与开发中具有独特的优势。Zeylenone(Zey)是从山椒子(Uvaria griandiflora)中分离得到的一种多氧取代环己烯类化合物。从1997年发现到至今,我们相继从生产工艺(合成/半合成)、药物制剂(纳米缓释制剂)、药效学及分子机制等进行了多方面的研究,发现Zey是一个非常值得深入开发且极具研究价值的抗肿瘤候选药物,但是Zey对于胃癌的抑制活性及作用机制是一个空白,仍不明确,尤其是Zey对胃癌侵袭及迁移的作用尚未报道和研究。实验目的:针对以上背景,本研究以胃癌为研究对象,探讨Zey是否可抑制胃癌细胞增殖、侵袭及迁移,并明确其潜在的作用机制。此外,建立体内的胃癌移植瘤模型,揭示Zey的体内抑瘤活性及分子机制,从而为Zey在胃癌治疗方面的开发应用奠定基础。实验方法:首先,通过MTT及平板克隆实验评价Zey对不同人胃癌细胞系的存活率及克隆性增殖的影响。在此基础上,一方面,通过划痕实验、Transwell实验初步探索Zey对胃癌细胞的侵袭迁移、运动能力的潜在影响;而后,检测Zey对胃癌细胞中基质金属蛋白酶2/9表达的影响,同时检测上游的AKT及ERK通路相关蛋白,深入明确Zey抑制胃癌细胞侵袭、迁移的主要作用机制。另一方面,从形态学、染色、凋亡率等方面,初步确定Zey降低胃癌细胞存活的生物学效应,深入阐明胃癌细胞的主要死亡方式,并通过线粒体膜电位检测,初步判断可能的信号通路,系统性研究并阐明Zey的潜在抗肿瘤效应的分子机制。此外,通过建立BGC823胃癌裸鼠移植瘤模型,研究Zey的体内抑瘤活性,对其体内药效学进行评价,而后,通过Western Blot法研究Zey对肿瘤组织内AKT通路相关蛋白表达的影响,以明确Zey体内抑制肿瘤生长的作用机制。实验结果:1、Zey抑制胃癌细胞增殖及集落形成Zey能够剂量依赖性地抑制多种胃癌细胞的增殖及集落形成,而对正常人胃上皮细胞GES-1的抑制作用不明显,说明Zey对胃癌细胞有效且有一定的选择性。2、Zey抑制胃癌细胞侵袭及迁移划痕实验表明,Zey作用24h后,胃癌SGC7901和MGC803细胞的运动迁移能力下降,划痕愈合率显著降低。Transwell实验中,Zey处理组的胃癌细胞穿过人工基底膜的细胞数较对照组明显减少,侵袭率及迁移率显著下降。这些结果共同说明了 Zey显著抑制胃癌细胞侵袭及迁移。3、Zey通过调控MMP的表达及上游的AKT和ERK通路抑制胃癌细胞侵袭、迁移AKT的活化加速肿瘤进程和远端转移,MMPs降解细胞外基质屏障,导致转移加速。Western blot结果显示,Zey显著下调胃癌细胞中MMP2、MMP9的表达,并且显著抑制AKT、ERK的磷酸化,说明Zey抑制侵袭迁移的作用与AKT/MMP2/MMP9 和 ERK 通路相关。4、Zey诱导胃癌细胞凋亡细胞形态及Hoechst 33258染色观察到,Zey组胃癌细胞出现凋亡特征。流式检测凋亡率结果表明,Zey作用胃癌细胞12h后,与对照组相比有明显的细胞凋亡;随着作用时间延长到24h,胃癌细胞的凋亡率逐渐增加。这表明Zey对胃癌细胞有显著的诱导凋亡作用,并且呈现明显的时间和剂量依赖性。5、Zey通过作用于内源性的线粒体凋亡途径诱导胃癌细胞凋亡Zey通过调控Bcl2家族蛋白(抗凋亡及促凋亡蛋白),使得线粒体膜的通透性增加,线粒体膜电位显著下降,进而激活下游凋亡效应者Caspase-3,启动凋亡的级联反应,最终导致胃癌细胞凋亡。6、Zey抑制胃癌BGC823裸鼠移植瘤的生长Zey高剂量组(30mg/kg)和紫杉醇给药组(15mg/kg)的移植瘤生长速度,均明显慢于对照组,二者抑瘤率分别为51.2%和51.4%,可见Zey对于胃癌体内成瘤具有显著的抑制作用。随后,对肿瘤组织中的AKT通路相关蛋白进行表达分析,也证实了前三章的发现:Zey能抑制AKT的活化,抑制MMPs的表达,进而抑制肿瘤体内的生长。结论:Zey在体外选择性抑制多种不同来源的胃癌细胞系的存活,同时抑制胃癌细胞的克隆性增殖;Zey体内也可抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长;创新性发现Zey抑制胃癌细胞侵袭及迁移,抑制基质金属蛋白酶的分泌,并且从内源性线粒体凋亡及侵袭迁移等方面进行了分子机制研究,发现Zey对胃癌的抑制作用与AKT/MMP2/MMP9、ERK 及 Bcl-2/Bax/Caspase3 通路密切相关。