大黄鱼(Pseudosciaena crocea)是我国主要的海水经济鱼类之一,几年来,越来越多的病害困扰着大黄鱼养殖业,阻碍了大黄鱼养殖业的健康发展。其中大黄鱼内脏白点病对于集约化养殖的危害极其严重,给养殖户造成了巨大的损失。本文以患病大黄鱼上分离鉴定得到的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)为研究对象,对变形假单胞菌全菌疫苗进行了初步的研究。主要内容如下:1.实验室条件下变形假单胞菌感染实验动物病理模型的建立选取了几种实验常用鱼,通过浸泡、腹腔注射和肌肉注射三种方式对实验鱼进行攻毒。筛选出对变形假单胞菌敏感并且有典型白点症状的鱼类,以作为实验室病理模型生物。结果表明:斜带石斑(Epinephelus coioides)更为敏感,白点病的症状更明显,患病率和白点率接近100%。所以选取斜带石斑作为实验室条件下变形假单胞菌实验的病理模型动物。2.变形假单胞菌灭活条件的筛选菌液的灭活有物理灭活法和化学灭活法。化学灭活法在细菌和病毒应用中更为广泛,为了得出变形假单胞菌的最佳灭活方案。本实验选取了三种化学灭活剂分别是甲醛、苯酚和氯仿,在不同灭活剂的浓度和温度下对变形假单胞菌进行灭活处理。选取三种灭活剂较为温和的条件下制备的灭活液对斜带石斑进行免疫实验,进而得出灭活条件温和且抗原免疫原性保护较好的一种灭活方案。本实验结果显示:三种药物较温和的灭活方案,分别为:福尔马林0.2%(v/v)的浓度在28℃灭活12 h,苯酚0.5%(v/v)的浓度在28℃处理24 h,氯仿3.5%(v/v)的浓度在28℃下处理12 h。三种灭活方案制备的变形假单胞菌疫苗对斜带石斑进行免疫实验后,得出三种灭活方案中甲醛制备的灭活疫苗对斜带石斑免疫后免疫效果最好。3.变形假单胞菌灭活疫苗注射佐剂筛选为了筛选出适合变形假单胞菌的免疫佐剂,添加不同的佐剂来提高变形假单胞菌的免疫效果。本实验选用了弗氏佐剂、铝胶佐剂、白油佐剂、佐剂206和蜂胶佐剂等5佐剂和变形假单胞菌疫苗制备成佐剂疫苗对斜带石斑进行注射免疫。实验结果显示:白油佐剂组、氢氧化铝佐剂、佐剂206、弗氏佐剂、蜂胶佐剂组对斜带石斑的免疫保护率分别为:91.67%、83.33%、80.56%、72.22%和66.67%,都显著高于对照组。实验结果说明佐剂可增强抗原的免疫原性并提高机体的免疫能力。4.口服微球疫苗的制备工艺采用海藻酸做为壁材对变形假单胞菌灭活液进行包埋,经过单因素实验对几种因素进行处理,得出干燥喷雾制备的条件为:海藻酸钠的浓度为2.5%,进风口温度为140℃,进样速度为600 mL/h,雾化压力为0.2 Mpa。制备的微球疫苗粒径比较小,有一定的耐酸性并在肠溶液中的有良好的释放性能。5.变形假单胞菌口服微囊疫苗对斜带石斑的免疫效果评价为了评价海藻酸钠包埋的变形假单胞菌口服微粒疫苗的免疫效果。按已确定的制备工艺制备变形假单胞菌微球疫苗,并对斜带石斑进行口服免疫。测定血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶和血清凝集抗体效价等免疫指标,并对斜带石斑进行人工感染实验来评价疫苗的免疫保护效果。结果表明,微球疫苗对斜带石斑免疫后,石斑鱼血清超氧化物岐化酶和溶菌酶的活性均得到了显著提高。变形假单胞菌微球疫苗组的血清抗体效价峰值为1:16,相对免疫保护力为28.94%,显著高于其他实验组。这说明海藻酸钠包埋的变形假单胞菌微球疫苗对变形假单胞菌病有一定的预防作用,海藻酸钠制备的微球对抗原有一定的保护作用。6.变形假单胞菌减毒活候选疫苗对斜带石斑保护力的影响通过基因沉默技术构建了变形假单胞菌两株基因稳定沉默株。结果显示,注射沉默菌株的斜带石斑死亡率明显降低。但沉默菌株还有一定的毒性,还达不到减毒疫苗的要求。