论文部分内容阅读
研究目的本实验在前期构建重组表达载体AAV-NGF-IRES-hrGFP的基础上,应用RNAi原理构建AAV-U6-shRNA-CMV-NGF-IRES-hrGF多功能载体质粒,特异性靶向p分泌酶（BACE1）表达沉默同时介导NGF表达增强,并在体外实验中筛选出有效的干扰质粒,为进一步以NGF和BACE1为靶点治疗老年痴呆症（AD）的体内研究提供一定的理论依据。方法1.pAAV-U6-shRNA-CMV-IRES-hrGFP干扰载体的构建根据NCBI中找到p分泌酶（BACE1）的mRNA序列,针对不同干扰位点设计3对siRNA寡核苷酸序列,设计一对无关序列作为阴性对照,合成相应的DNA片段。采用基因克隆技术,将其插入RNAi表达质粒pSilencer中,构建出质粒pSilencer-U6-shRNA。然后通过PCR从中扩增出U6-shRNA片段,并将其克隆至pAAV-MCS-IRES-hrGFP,构建出pAAV-U6-shRNA-CMV-IRES-hrGFP并进行酶切和测序鉴定。2.pAAV-shRNA-U6-CMV-NGF-IRES-hrGFP多功能载体的构建从含有NGF的载体中通过PCR扩增得到NGF基因,将其插入rAAV-U6-shRNA-CMV-IRES-hrGFP质粒的多克隆位点中,构建出pAAV-U6-shRNA-CMV-NGF-IRES-hrGFP重组质粒并进行酶切和测序鉴定。3.内源性表达NFG和BACE1双基因的体外实验细胞系筛选培养BT-325等4种神经系统肿瘤细胞和SW1990胰腺癌细胞,分别提取总RNA,逆转录合成cDNA,通过RT-PCR方法扩增NGF,BACE1基因,筛选出内源性表达NFG和BACE1双基因的细胞系。通过磷酸钙共沉淀方法转染pAAV-GFP质粒,比较细胞GFP表达筛选出高效率转染的细胞系。4.筛选有效靶向BACE1沉默和介导NGF上调的多功能rAAV质粒利用磷酸钙共沉淀法将各实验组质粒分别转染BT325细胞。通过倒置荧光显微镜观察转染细胞GFP表达情况确定转染效率；通过Real-time PCR、Western-Blot、ELISA方法分别从mRNA及蛋白水平检测BACE1和NGF表达效果。筛选有效靶向BACE1沉默和介导NGF上调的多功能rAAV质粒。结果1.构建了能够在细胞内产生靶向BACE1基因沉默的shRNA的rAAV质粒。2.构建了特异性靶向BACE1表达沉默同时介导NGF表达增强的多功能rAAV质粒。3.筛选出BT-325,SK,SW1990细胞内源性表达NFG和BACE1双基因；磷酸钙共沉淀法可高效率地将pAAV质粒转染至BT325细胞。4.各组shRNA表达质粒靶向BACE1基因不同的干扰位点导致其干扰效果也不一样,shRNA1和shRNA2的抑制效果明显优于shRNA3。多功能质粒成功转染TB-325细胞后,体内表达法合成的shRNA有效地抑制细胞内BACE1基因的表达,同时能增强这些细胞NGF基因的表达。结论本研究成功地构建了有效靶向BACE1表达沉默和介导NGF表达增强的rAAV质粒,并且通过磷酸钙共沉淀法将pAAV瞬时有效地转染至BT325细胞,通过对细胞NGF、BACE1表达水平分析,筛选出能在细胞中特异地靶向BACE1沉默同时又能高效地增强NGF表达的rAAV质粒。