白癜风是一种累及皮肤及黏膜的色素脱失性疾病。该病严重影响患者的容貌，同时对患者带来了沉重的心理负担。目前该病的病因病机尚未得以阐明，发病学说多达十余种，致使其缺乏有效地预防与治疗手段。我们课题组通过多年的探索与研究，结合国内外研究成果，对该病的发病机制提出了新的观点：即白癜风发病的启动因素是氧化应激，进展的推动因素为自身免疫，在氧化应激的作用下，体内的黑素细胞发生凋亡，进而引发自身免疫反应，进一步损伤黑素细胞，形成一个递进的环路，造成局部黑素细胞的缺失，导致白癜风的发生。在这一病理过程中，黑素细胞的异常凋亡有何特点？如何引发自身免疫反应？成为我们关注的科学问题。钙网织蛋白（CRT），是一种定位于内质网的储钙蛋白，其主要功能为调节钙离子平衡。近年来，研究发现在一些特定的氧化应激条件下，过表达CRT可以引起包括心肌细胞、Jurket T细胞等对凋亡的敏感性；同时，CRT还参与了一些自身免疫疾病的发生发展，包括SLE、炎症性肠病及类风湿性关节炎等。人们发现当受到一些特定的应激时（包括氧化应激与内质网应激），胞内的CRT会外翻于细胞膜表面，诱导细胞发生免疫原性的凋亡，这是一种特殊的凋亡方式，可进一步引起机体的免疫清除。该现象与白癜风中黑素细胞的凋亡机制密切相关，但并无类似报道，这成为研究白癜风发病机制的一个重要领域。进一步研究发现，CRT与整合素相关蛋白分子（CD47）密切相关。我们通过总结文献发现，细胞表面的CRT发挥着“eat mesignal”的角色，吸引DC细胞对凋亡细胞的吞噬；与此同时，CD47做为一种细胞表面的蛋白，通过其在吞噬细胞表面的配体SIRPα发挥阻止凋亡细胞被吞噬的作用，扮演着“don’t eat me signal”的角色。Mark P.Chao等学者已经证实，在正常细胞及肿瘤细胞中，CRT与CD47的表达具有很强的相关性。在实验中，他们将肿瘤细胞表面的CRT定义为“eat me signal”，即在敲出了CD47情况下，发挥着引导吞噬的作用。免疫荧光的结果显示，当许多类型的细胞发生凋亡时，CD47的表达都会降低，与CRT呈负相关。同时，在T细胞中，CD47与其配体SIRPα的绑定与T细胞的活化及DC引导产生抗原特异性CTL反应也具有相关性。国内外学者及我们课题组前期已报道在白癜风患者皮损周围有CD8+CD4+T细胞的浸润。这些发现又为我们的研究带来了新的思考与探索。即氧化应激下的黑素细胞表面CRT与CD47是否也存在着平衡相关性，是否都参与了白癜风的发生发展过程，CRT是否能成为连接氧化应激与自身免疫反应间的桥梁？此外，近年来的研究表明，白癜风发病机制中黑素细胞也是被自身免疫所清除，这一过程中，是否有免疫原性凋亡的发生和CRT的参与？其与自身免疫反应的关系如何成为我们研究的重点。基于文献回顾和课题组既往研究，针对上述疑问，我们提出如下假设：氧化应激条件下，黑素细胞内PERK通路异常活化，发生内质网应激，诱导CRT膜表面聚集（Endo-→Ecto-），细胞的表面分子性质改变，免疫原性增强，促进抗原提呈和T细胞免疫反应，推动白癜风疾病进程；我们在验证这一假说的同时，拟探讨了抑制PERK通路过度活化，降低黑素细胞免疫原性的可能应用前景，为白癜风的治疗提供新靶点及理论基础。方法本研究利用人永生化黑素细胞系（PIG1）和白癜风患者永生化黑素细胞系（PIG3V）模型中，通过流式细胞术、实时定量PCR、Western blot、激光共聚焦显微镜等实验方法，观察CRT在黑素细胞中的定位变化及其与时间的依赖性；通过构建过表达CRT质粒、knockdown CRT等方法，证明其对黑素细胞凋亡的调节作用；利用免疫组化及ELISA等方法，检测临床样本血浆中CRT、CD47含量的差异，并通过人PBMC和CRT共孵育的方法，检测上清中细胞因子（IL-6与TNF-α）的含量变化，观察CRT对PBMC促炎症因子分泌的作用。结果1．选择由高到低（1000μmol/l、800μmol/l、400μmol/l、200μmol/l、0mol/l）浓度的H₂O₂，处理黑素细胞24h后用Annixin V来检测细胞的凋亡情况并做统计学分析，综合实验结果及相关文献，选择早期凋亡有统计差异而坏死无差异的刺激浓度做为实验浓度，即PIG1和3V分别为400μmol/l、200μmol/l。2．用实验浓度H₂O₂（400μmol/l及200μmol/l）分别处理PIG1和PIG3V0h、15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h后，通过Real-time PCR、Western Bolt检测总CRT mRNA和蛋白的表达情况：结果显示，PIG1及3V的CRT在4h之前显著升高，呈时间依赖性，在4h后出现时间依赖性的下降。该结果提示随着氧化应激浓度的增高，CRT表达增多，而在4h之后，黑素细胞由凋亡进入坏死状态，做为凋亡的标志物之一，CRT的表达已不具有特异性，因此也是其下降的主要原因。3．为了观察黑素细胞凋亡时其表面分子的变化情况，根据前期确定的刺激浓度与时间，对膜上的CRT与CD47进行了检测。结果显示：与未受刺激的细胞相比，细胞膜CRT阳性的细胞随时间增加而增多，即15%⁴5%；在同样的刺激条件下，细胞膜CD47的表达量（与CRT抗衡的分子）变化趋势与CRT相反，与未受刺激的细胞相比，CD47阳性的细胞百分比随着时间延长从42%降至10%，同时我们也利用免疫荧光对这一现象进行了直观的分析与观察，与流式结果一致。4．对PIG1和PIG3V分别以400μmol/l、200μmol/l的H₂O₂刺激2h后，流式检测凋亡的情况，结果显示，过表达CRT组的凋亡水平明显高于对照组；CRTknockdown组的凋亡水平明显低于对照组，以上结果证明，CRT对黑素细胞的凋亡起着正向调控的作用，即过表达CRT会引起黑素细胞凋亡的敏感性增加，knockdown CRT使其凋亡的敏感性降低。5．经ELISA对患者/正常人血浆中的CRT进行检测，结果显示：白癜风患者血浆中CRT的平均水平为156.3±10.61pg/ml，高于正常人平均水平111.9±8.25pg/ml，经统计学分析，其间p值为0.0019；CD47的检测结果显示：正常人血浆的平均水平为106.8±1.44pg/ml，而白癜风患者的平均水平为96.2±1.14pg/ml，统计学分析其p值<0.0001；抗CRT抗体的检测结果，却与抗原水平相反，即白癜风患者的平均值为176.9±13.27pg/ml，正常人的平均值为235.7±19.9pg/ml，其p值为0.0186；进展期、稳定期患者血浆中CRT表达的差异，经统计学分析，处于进展期的患者CRT的表达水平（213.016±25.363）明显高于稳定期患者（106.012±13.753），p=0.0002。6．通过免疫组化染色、激光共聚焦对比正常人及白癜风患者皮损局部CRT表达变化，结果显示白癜风患者黑素细胞周围聚集较多的CRT，而正常人黑素细胞周围聚集较多的CD47。将CRT与PBMC共孵育，用ELISA检测IL-6及TNF-α的分泌水平，结果显示：与CRT共孵育后，白癜风患者PBMC中IL-6的平均水平为724.6±11.40pg/ml，TNF-α的平均水平为54.78±4.076pg/ml，而未与CRT共孵育组的平均水平则为657.1±19.67和22.39±2.975pg/ml，p值分别为0.0196和0.0003。结论1．氧化应激下，黑素细胞中CRT会从胞内翻转至膜上，并调节着黑素细胞的凋亡，过表达CRT使得黑素细胞对凋亡的敏感性增强，抑制其表达则会降低凋亡敏感程度。该结果首次提示氧化应激条件下，CRT对黑素细胞的损伤起着关键的作用。2． CRT与CD47抗原成为一个平衡体，在体外及白癜风患者血浆中，CRT升高的同时伴有CD47的下降，而这一结果在正常人中却是相反的。另外，通过对比稳定期与进展期白癜风患者血浆中CRT的差异，发现进展期的CRT水平高于稳定期。提示CRT做为一个与自身免疫相关的抗原，不仅在一些自身免疫性疾病中发挥着作用，也与白癜风的发病进程有着密切的联系；同时，氧化应激条件下，CD47“非吞噬信号”的保护作用降低，黑素细胞容易被免疫系统识别并杀伤。3．通过共孵育患者外周血PBMC与CRT，与未孵育组相比，炎症因子IL-6、TNF-α分泌增加。进一步提示膜型CRT的表达，促进炎症因子的分泌，参与白癜风发病中的免疫损伤。4．以上的结果提示，黑素细胞处于H₂O₂诱导的氧化应激刺激时，细胞内的CRT外翻于细胞表面，参与黑素细胞的凋亡，并诱导异常免疫应答。该研究结果为阐明白癜风的发病机制提供了新的方向和思路。