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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是一种全球性的柑橘生产上的毁灭性病害,目前已在亚洲、非洲、南美洲、北美洲及大洋洲的近50个国家/地区发生流行。尽管HLB病原迄今尚未实现体外培养,但有三种韧皮部杆菌属细菌与该病紧密相关,也被认为是该病的病原,分别为:柑橘黄龙病菌亚洲种(′Candidatus Liberibacter asiaticus′,Las)、柑橘黄龙病菌非洲种(′Ca.L.africanus′,Laf)和柑橘黄龙病菌美洲种(′Ca.L.americanus′,Lam)。其中,Las发生流行最为广泛,在我国发生流行的HLB病原也是该种细菌。我国HLB发生历史已有一个世纪,是该病的最早发生地之一,但其境内的Las并未完成过全基因组测序。因此本研究主要对我国的Las进行全基因组序列测定,并基于测定的基因组序列,挖掘多态性分子标记并对来自全球的Las进行遗传多样性研究。此外,基于遗传多样性研究中发现的一个长串联重复位点的序列特性,建立一种Las的高灵敏性分子检测技术。取得的主要结果如下:1.完成了首个中国Las(gxpsy分离物)全基因组序列的测定。该分离物基因组大小为1268237 bp,G+C含量为36.5%,含有3个完整的核糖体RNA操纵子、44个tRNA和1141个蛋白编码基因(其中368个为假定基因)。gxpsy分离物基因组中基因的数量、构成以及分布基本与已公布的Las psy62分离物一致。但与psy62分离物基因组中只含一个前噬菌体序列区不同的是,gxpsy分离物基因组中串联有两个不同的前噬菌体序列区,其中位于1223783~1263670位核苷酸的前噬菌体序列区与psy62分离物基因组中的前噬菌体序列区具有高度同源性,相似性达94.4%。2.基于变形菌门细菌基因组中共有的50个直系同源蛋白的氨基酸序列构建了系统发育树,发育树显示:在韧皮部杆菌属细菌中,难培养的Las、Laf、Lam以及茄科作物上的病原菌′Ca.L.solanacearum′(Lso)均进化较快,而迄今唯一可体外培养的韧皮部杆菌属细菌L.crescens(Lcr)则进化较慢;Las与Laf的亲缘关系最近,其次依次为Lso和Lam,与Lcr的亲缘关系最远。在Las不同分离物间,gxpsy分离物与psy62分离物之间未见明显分化。3.对Las基因组上的可变数量串联重复序列(VNTR)位点进行了筛选,共筛选获得八个VNTR位点,并基于这八个VNTR位点对来自全球不同地理区域的Las分离物进行了多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA),基于MLVA数据的非加权配对法(UPGMA)聚类分析表明,来自世界各地的436个Las可分成5个组群:大多数佛罗里达州分离物、部分加利福尼亚州分离物以及所有来自德克萨斯州、墨西哥和伯利兹的分离物聚成了组群A;大多数来自东南亚国家的分离物以及部分美国加利福尼亚州分离物和1个印度分离物聚成了组群B;除了1个分离物外,其余印度分离物单独聚成了组群C;来自中国的2个分离物单独聚成了组群D;所有来自巴西的分离物、少部分佛罗里达州分离物和少数东南亚分离物聚成了组群E。在美国佛罗里达州发生流行的HLB是由2个组群(A和E)的Las引起,根据这两个组群在佛罗里达州的分布,推测近年来组群A主要延东部沿海地区向北扩散,而组群E主要延西北方向向内陆扩散。在美国加利福尼亚州发现的HLB也是由2个组群(A和B)的Las引起。此外,通过MLVA分析还发现12.8%的HLB样品为Las混合株系侵染,进一步的分析发现某一地区中Las混合株系侵染的发生率与该地区HLB发生历史的长短成正比。4.在Las基因组上挖掘了LF-InDel-3和LF-InDel-4两个大片段DNA插入缺失(LF-InDel)位点,通过对全球504个该菌分离物基因组中上述两个位点的插入缺失情况进行检测发现:LF-InDel-3位点DNA片段缺失型Las仅在北美洲有分布,并且为该地区的优势组群,而所有来自亚洲国家以及南美洲巴西的Las均为该位点DNA片段插入型;在LF-InDel-4位点上,在高海拔及高纬度平均气温较低区域,在种群中占优势的组群为该位点DNA片段插入型Las,而在平均温度相对较高的地区,在种群中占优势的组群为该位点DNA片段缺失型Las。此外还发现LF-InDel-3位点DNA片段的缺失会连锁导致LF-InDel-4位点的DNA片段也缺失,而LF-InDel-4位点DNA片段的插入则会连锁导致LF-InDel-3位点的DNA片段也插入。5.在串联重复位点研究的基础上,建立了一种基于串联重复序列的Las聚合酶链式置换反应(TR-PCDR)检测方法。TR-PCDR方法使用了一对特殊设计的引物,其中上游引物结合位点位于Las基因组中TR区域,下游引物结合位点为临近TR区域的保守序列区域,通过配合使用一种具有链置换活性但缺乏5′-3′外切酶活性的热稳定性DNA聚合酶,TR-PCDR每轮反应产生的扩增子数量为起始数量的2倍以上,从而提高扩增效率。建立的TR-PCDR检测方法的检测灵敏度达到10拷贝/μL,比常规PCR高100倍,与实时荧光定量PCR的检测灵敏度相当。田间样品的实际检测结果也表明,TR-PCDR检测灵敏度高于常规PCR,和实时荧光定量PCR接近。由于TR-PCDR操作门槛低,可在任何常规热循环仪上进行,因此具有广泛应用空间。