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兴奋性突触突触后亲离子型谷氨酸受体主要是AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxaz01epropionate, AMPA)受体和NMDA(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体,二者协同完成兴奋性突触的传递和介导复杂的生理功能.已知NMDA受体与许多复杂的生理和病理机制有关,如突触的可塑性、长时程增强作用(LTP)、学习和记忆、兴奋性神经毒性、神经退行性变性疾病等.
已克隆到7个编码NMDA受体亚单位蛋白的基因,即NRl、NR2A-2D和NR3A,3B.其中NR1为一个独立的基因,但可产生8个剪接变体;NR2现共有4个相关的基因,NR2A、NR2B、NR2C和NR2D;NR3现则有2个基因,分别为NR3A和NR3B.重组受体的研究表明:NRl亚单位是NMDA受体复合物的必需组分,而不同的NR2亚单位则可与NR1形成具有不同通道特征的NMDA受体复合物.
NMDA受体普遍认为是由NR1和NR2亚单位组成的异四聚体.目前关于NMDA受体的功能性研究已经非常深入,但是,NMDA受体装配的选择性调控机制还不是很清楚.而且还没有找到特定NMDA受体各亚基上控制形成同聚或者异聚体的区域.先前有研究报道,NMDA亚单位的N末端对于受体的装配有主要作用.该实验是建立在免疫共沉淀的方法之上,尽管实验技术比较成熟,但是,由于要经过细胞裂解搜集等步骤常常不能反映生理情况,或者不能用于活细胞的观测.近年来一种新的荧光技术--荧光共振能量转移(FRET)被广泛地应用到受体装配的研究,该方法可以检测距离在10nm之内的蛋白之间的相互作用,而受体亚单位复合物之间的距离已被普遍认为在此范围之内,而且该技术可以实现活细胞内的实时观测,我们实验室利用此方法,通过N端不同区域截短的实验发现,N端在NMDA受体亚单位同聚体和异聚体装配中并不起到决定性的作用.
为了更进一步的研究NMDA受体N末端对受体装配的作用,我们首先选择了NRl亚单位,因为不同的NRl剪接变体也赋予NMDA受体通道不同的功能特征,而且NRl广泛表达于各个脑区,是NMDA受体通道的必要组成成分,有一定的代表性.然后构建了NRl与GluR2的N末端不同区域(ATD,Sl,以及NT)的嵌合体,包括:XFP.NRl-ATD-GluR2,XFP-NR1-S1-GluR2,XFP-NR1-NT-GluR2.经酶切和测序鉴定确定构建物的正确性,进一步转染HEK293细胞证实这些CFP和YFP标记的受体亚单位具有良好的荧光信号.以这些表达载体为工具,结合活细胞表面受体免疫染色技术和荧光能量转移技术,我们进一步观察了这些嵌合体之间,或者与野生型NR1,NR2亚单位的装配,膜表面表达情况,获得了如下研究结果:
(1)为了研究NRla亚单位N末端是否存在协同NR2B亚单位到达膜表面的功能区,将XFP-NR1-ATD-GluR2,XFP-NR1-S1-GluR2 XFP-NR1-NT-GluR2,分别与NR2B共转染到HEK293细胞中去,然后采用抗GFP抗体和Cy3交联的二抗对转染细胞作活细胞表面染色,结果发现这些嵌合体都不能获得表面表达.同时,全细胞式电生理记录这些嵌合体与NR2B共转染的HEK293细胞,也未能记录到NMDA受体电流.这些结果提示NRla亚单位N末端能帮助NRla/NR2B获得表面表达.而替换为同源型较高的GluR2亚单位并不能使得其表面表达.
(2)为了探究是否CFP-NR1-NT-GluR2,YFP-NR1-NT-GluR2能在细胞内形成同聚体,将其共转染到HEK293细胞中去,然后用活细胞荧光成像技术,检测其三通道荧光值计算荧光能量转移情况,发现其能在细胞内部形成同聚体.在CFP-NRl-ATD-GluR2,YFP-NRl-ATD-GluR2,CFP-NR1-S1-GluR2,YFP-NR1-S1-GluR2两组共转染时也发现了类似的结果.这可能提示NRla嵌合体彼此之间可以借助NRl片段之间的或嵌入的GluR2片段之间的相互作用可以很好地装配.同时我们还发现,CFP-NRl-NT-GluR2可以与野生型NRl或NR2B亚单位装配,这进一步提示NRla嵌合体的构建本身不影响亚单位的膜拓朴学结构,同时也提示NR1的N末端对于NMDA受体的装配没有决定性作用.