猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)诱发的主要以母猪生殖障碍和仔猪呼吸障碍为表现症状的传染病。PRRSV存在严格的细胞侵袭性,它主要在猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophage,PAM)中进行复制,既可以使机体发生免疫调节紊乱,又可以刺激机体产生免疫保护。PRRSV感染后会引起猪群的免疫抑制、持续传染和抗体依赖性增强作用(Antibody dependent enhancement,ADE)等,此外,中和抗体产生迟缓,不能完全清除病毒,导致机体持续带毒,病毒血症反复发作,造成很多其他病原体的感染,是目前严重危害我国养猪业一大疾病。黏膜免疫系统作为机体的第一道免疫防线,在抵挡病原方面有重要作用。近些年,有不少对黏膜免疫的研究证明了黏膜免疫对某些疾病防控的有效性,所以研究PRRSV的黏膜免疫对于改进该病的免疫策略具有重要指导意义。为了解PRRSV HeN-3弱毒株经滴鼻和注射两种不同途径感染仔猪后,仔猪体内病毒增殖、抗体产生及细胞因子变化规律的差异。本试验选取12头20日龄健康仔猪,随机分3组,即滴鼻组、注射组和对照组。分别于感染后的不同时间点采取血液(凝血和抗凝血)和唾液,最后一次采取完血液和唾液后,采取猪的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、下颌淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结,并无菌收集PAM细胞。通过实时荧光定量PCR方法(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)分别检测其中的病毒载量:制作病理切片分析组织病变情况;通过间接ELISA方法检测血清和唾液的抗体水平;通过基于PAM细胞的中和试验检测血清和唾液的中和抗体效价;通过RT-qPCR方法检测外周血淋巴细胞中细胞因子IL-1β、TNF-α、LAG-3和PD-1的变化规律,使用ELISA试剂盒检测血清中IFN-α的变化规律。一、两种途径接种仔猪的病毒增殖规律的差异比较分别于感染后第0、3、7、11、15、1 9、23、27、31、35、39、43天采取血液(分离血清)和唾液,最后一次采取完血液和唾液后,采取猪的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、下颌淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结,并无菌收集PAM细胞。通过RT-qPCR方法分别检测血液、唾液、脾脏、下颌淋巴结、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结和PAM细胞中的病毒载量;制作肝、脾和肾脏的病理切片分析组织病变情况。结果表明:①病毒血症从第3天持续到第31天,病毒血症会反复出现,滴鼻组较注射组血液里的病毒血症持续时间短且病毒含量低。②滴鼻组唾液在15-27天,注射组唾液在15-31天时检测到102-103拷贝/μL的低拷贝数病毒的存在,唾液存在潜在的散毒风险。③病毒在猪体内持续存在且注射组的病毒拷贝数稍高于滴鼻组。④部分组织有轻微的病理变化,且两试验组之间无明显异常。二、两种途径接种仔猪的抗体产生规律的差异比较分别于感染后第0、3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43天采取血液(分离血清)和唾液,通过间接ELISA方法检测血清和唾液的抗体水平。结果表明:①血清IgG抗体水平一直处于逐渐上升趋势,两试验组均于第11或15天血清抗体转阳,31天前滴鼻组抗体水平较高于注射组,3 1天后注射组基本一直高于滴鼻组,注射免疫能刺激猪只产生更高水平的血清抗体。②唾液IgA抗体水平逐渐上升,滴鼻组和注射组分别于第15或19,第19或23天时唾液中抗体转阳,19～23天,27～31天抗体水平达到高峰,随后抗体水平逐渐降低,滴鼻组的抗体水平基本一直高于注射组,滴鼻免疫能刺激猪只产生更高水平的唾液抗体。三、两种途径接种仔猪的中和抗体产生规律的差异比较分别于感染后第0、3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43天采取血液(分离血清)和唾液,通过基于PAM细胞的中和试验分别检测血清和唾液的中和抗体效价。结果表明:①在血清中,滴鼻组的抗PRRSV中和抗体效价在感染后第35天达到1:2,最高中和效价为1:8;注射组在感染后第19达到1:2,最高中和效价为1:4;滴鼻免疫比注射免疫刺激猪只血清中较晚地产生中和抗体但水平高。②在唾液中,滴鼻组的抗PRRSV中和抗体效价在感染后第19天达到1:2,最高中和效价为1:8;注射组在感染后第35天达到1:2,最高中和效价为1:4滴鼻免疫比注射免疫能刺激猪只唾液中更早地产生更高水平的中和抗体。③唾液中的抗体在32倍稀释时出现促进病毒增殖的现象。四、两种途径接种仔猪的细胞因子产生规律的差异比较分别于感染后第0、3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43天采取抗凝血,通过RT-qPCR方法检测外周血淋巴细胞中细胞因子IL-1β、TNF-α、LAG-3和PD-1的变化规律,使用ELISA试剂盒检测血液中IFN-α的变化规律。其中IL-1β和TNF-α的RT-qPCR方法为本实验室已建立的,LAG-3和PD-1的RT-qPCR方法为本试验所建立。结果表明:①PRRSV毒株感染后可以促进猪体外周血淋巴细胞中IL-1β、TNF-α、LAG-3和PD-1以及血清中IFN-α的表达。②滴鼻组干扰素(IFN-α)和炎性因子(IL-1β和TNF-α)的变化趋势都早于注射组,而滴鼻组的免疫抑制因了(LAG-3和PD-1)的变化趋势晚于注射组。③无论通过哪种方式进行免疫,均诱导细胞因子产生相似的变化趋势。④滴鼻组因子(IFN-α和LAG-3)水平与PRRSV拷贝数之间的相关性高于注射组,因子的表达量与病毒拷贝数以及免疫方式均有关。总结:滴鼻免疫较注射免疫诱发较低水平和较短时间的病毒血症,刺激猪只唾液中更早地产生更高水平的中和抗体,更早的促进猪体外周血淋巴细胞中IL-1β和TNF-α及血清中IFN-α的表达,较晚地促进猪体外周血淋巴细胞中LAG-3和PD-1的表达,说明PRRSV弱毒株经滴鼻免疫较注射免疫诱发机体产生较强的免疫反应,可能为机体提供更有效的免疫保护作用,黏膜免疫对于改进PRRSV弱毒疫苗的免疫策略具有重要的指导意义。