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手性醇是一类重要的手性中间体,可广泛地用于合成手性药物、农业化学品、香料等,如3-羟基丁酸乙酯(Ethyl3-hydroxybutyrate, EHB),其手性单一异构体(R)-EHB和(S)-EHB均是非常有前景的手性合成砌块。目前通常采用微生物细胞催化来制备对映体纯EHB。与游离酶相比,微生物全细胞的稳定性及选择性更好,且不需要添加昂贵的辅酶。此外,固定化细胞可重复使用,降低生产成本,简化生产工艺。近年来,有关生物催化乙酰乙酸乙酯(Ethyl acetoacetate, EAA)不对称还原成(S)-EHB的研究报道较多,但是利用微生物细胞催化EAA不对称还原为(R)-EHB的研究报道甚少,且获得的产率和产物的e.e.值颇低。因此,本论文对比研究不同反应介质[尤其是含离子液体(1onic liquids,ILs)介质]中固定化Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化EAA不对称还原生成(R)-EHB的反应特性,并系统探讨各相关因素对该反应的影响规律,考察固定化Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞的操作稳定性及其催化EAA不对称还原的扩大反应,并建立高效、高选择性地合成对映体纯(R)-EHB的生物催化反应体系。在所研究的5株微生物菌种中,本课题组从“中华开菲尔菌粒(China kefir)"分离纯化得到的醋酸杆菌Acetobacter sp. CCTCC M209061,其能高效地催化EAA不对称还原成(R)-EHB,且得到有较高的产率和产物的e.e.值。采用海藻酸钙-壳聚糖包埋-覆膜法,对醋酸杆菌细胞进行固定化,所得的固定化细胞在储藏稳定性、热稳定性和操作稳定性均优于游离细胞,且其催化EAA还原反应的产率与游离细胞相当(约71%),产物的e.e.值99.0%以上,故选择固定化醋酸杆菌细胞作为催化剂进行下一步的研究。在水相反应体系中,固定化细胞催化EAA不对称还原反应的最适底物浓度、缓冲液pH值、辅底物及其浓度、固定化细胞浓度、反应温度和转速分别为35mmol/L,5.5,80mmol/L葡萄糖,0.45g/mL、35℃,200r/min;在此最适条件下,反应的初速度、最大产率及产物的e.e值分别为1.28μmol/min,82.6%和99.0%以上。显然,在水相中进行该反应,底物浓度较低,且存在较为严重的底物和产物抑制。为了解决上述问题,本研究尝试在水相体系中加入疏水性有机溶剂,以期利用固定化材质的亲水性来保护微生物细胞,使其处于饱含水的微环境中,同时利用有机溶剂对底物和产物的萃取作用,来降低底物和产物在固定化细胞中的浓度,从而减轻底物和产物抑制。本论文对比研究了7种有机溶剂(乙酸乙酯、环己烷、正己烷、正辛烷、异辛烷、辛醇和甲苯)与缓冲液组成的双相体系对该反应的影响。与其他有机溶剂相比,正己烷的生物相容性最好。当正己烷的体积占反应总体积的100%时(即反应介质为正己烷),反应效率最好；在其反应体系中进行该反应的最适条件为：底物浓度40mmol/L、辅底物为异丙醇,其浓度60mmol/L、反应温度35℃以及转速220r/min;在此条件下,该反应的初速率为0.72μmol/Lmin,最大产率和产物的e.e.值分别为85.2%和99.0%以上。研究表明,含有机溶剂的反应体系对固定化细胞的毒性较大,导致细胞的催化活性大大下降。为解决上述问题,本文采用具有良好生物相容性的新型介质ILs替代有机溶剂作为第二相。在所研究的9种疏水ILs中,C4MIM·PF6具有最好的生物相容性,同时EAA和EHB在C4MIM·PF6/缓冲液两相中的分配系数最高,故能有效地减少水相中的底物和产物抑制,因此C4MIM·PF6为最适IL相。在C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中,反应的最适两相体积比(C4MIM·PF6/缓冲液)、反应温度、缓冲液pH值、转速和底物浓度分别为2:1、35℃、5.5、220r/min和55mmol/L;在上述反应条件下,该反应的初速率、产率和产物的e.e.值分别为1.16μmol/min,90.8%和99.0%以上本研究试图通过代谢调控途径,向水相体系中添加亲水性咪唑类ILs,以期降低胞内的产物浓度,提高反应效率。研究发现,组成ILs的阴、阳离子类型对该反应有较大影响。在所考察的ILs中,C2OHMIM·Cl对细胞的毒性最低,故在含C2OHMIM·Cl的缓冲液混合体系中反应效率最高,Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞表现出最佳的催化效果,因此C2OHMIM·Cl为该反应最适IL。在此体系中,该反应的最适缓冲液pH值、反应温度、C2OHMIM·Cl浓度、转速和底物浓度分别为5.5、35℃、0.5mol/L、200r/min和45mmol/L时,该反应的初速度、最大产率和产物e.e.值分别为4.90umol/min、95.3%和99.0%以上。在最适反应条件下,该反应规模扩大至500mL,反应初速度为4.78μmol/min,分离纯化得至(R)-EHB的产率高达94.9%,产物的e.e.值仍保持在99.0%以上,显示出巨大的应用潜力。在以上所考察的四种反应体系中,固定化细胞在C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中的操作稳定性最好,而在正己烷反应体系中的操作稳定性最差；反应效率及产物的产率在C2OHMIM·Cl-缓冲液混合体系中最好。本研究不仅有助于丰富对含ILs介质中固定化细胞催化特性的认识,还提供了一条还原β-酮酯行之有效的新途径。