论文部分内容阅读
EAAT3(excitatory amino acid transporter 3)是肠道上皮细胞(intestinal epithelial cell,IEC)主要的酸性氨基酸(包括谷氨酸和天冬氨酸)转运载体。为了研究EAAT3对猪肠上皮细胞系IPEC-J2(porcine jejunal epithelial cell line)细胞增殖和氨基酸转运的影响,本试验采用PCR扩增技术,克隆得到长白猪EAAT3 cDNA序列并构建过表达载体,获得EAAT3过表达的IPEC-J2稳转细胞株。在此基础上,设计并合成EAAT3 RNA干扰序列,对IPEC-J2细胞中的EAAT3进行RNA干扰。利用全自动氨基酸分析仪检测了EAAT3对游离氨基酸转运的影响;应用MTT和细胞计数检测了EAAT3对IPEC-J2细胞增殖的影响;采用real-time PCR和Western blot技术,分析EAAT3对mTOR信号通路关键蛋白和谷氨酸/胱氨酸转运载体xCT表达水平的影响。为开展谷氨酸感应转运的研究奠定基础。试验结果如下:(1)猪EAAT3 cDNA克隆及EAAT3过表达稳转细胞株的获取同源性克隆得到长度为1575 bp的猪EAAT3 cDNA片段。构建过表达载体EAAT3-pcDNA3.1+,筛选获得EAAT3过表达的稳转细胞株。细胞免疫荧光技术、real-time PCR和Western blot鉴定EAAT3成功过表达。(2)EAAT3在IPEC-J2细胞中有效RNA干扰的获取根据克隆得到的EAAT3完整CDS序列设计3对干扰序列,real-time PCR和Western blot鉴定EAAT3 RNA干扰情况,获取最佳干扰序列siRNA-003的最佳干扰时间点为48 h。(3)EAAT3对IPEC-J2细胞氨基酸转运和细胞增殖的影响EAAT3在调控酸性氨基酸转运的同时过表达后可以显著促进胱氨酸的转运(P<0.05)并且RNA干扰后可以显著抑制胱氨酸的转运(P<0.05)。MTT和细胞计数的结果显示,EAAT3过表达组的细胞增殖能力显著高于对照组(P<0.05)。(4)EAAT3对mTOR信号通路关键蛋白的影响EAAT3过表达后可以显著上调mTOR信号通路关键蛋白的表达水平(P<0.05);EAAT3 RNA干扰后可以显著下调mTOR信号通路关键蛋白的表达水平(P<0.05)。(5)EAAT3对ATF4/xCT途径的影响EAAT3过表达后可以显著上调xCT及其转录因子ATF4的表达水平(P<0.05);EAAT3 RNA干扰后可以显著下调xCT及其转录因子ATF4的表达水平(P<0.05)。结论:(1)猪EAAT3可能通过转运谷氨酸进而激活mTOR信号通路促进肠上皮细胞增殖。(2)为了维持谷氨酸代谢池的稳态,mTOR信号通路被激活后可能通过协同调控谷氨酸/胱氨酸转运载体xCT转运胱氨酸和谷氨酸。