背景目前,随着核电站和其他民用放射源的不断增加,医疗中对肿瘤行放疗方法治疗的广泛应用,核泄漏事故、核辐射污染及放射性核损伤引起人们越来越多的关注。根据国际及国内相关的统计资料表明,对于急性放射性损伤的患者,如果受照射剂量在6Gy以下,大多数病人通过治疗可获得满意疗效;但当其受到辐射剂量超过8Gy时,几乎没有发现有病例能够长期存活。其中,重度骨髓型及肠型放射性疾病的研究,是摆在世界医学研究者面前的一个重大难题。急性放射病中的肠型急性放射病,具有病情危重,疾病进展迅速,生存时间相对较短的特点,其临床症状包括腹痛、呕吐、腹泻、血便、急性腹膜炎、肠梗阻等,临床救治成功率低。在肿瘤的多种综合治疗方法中,放疗一直发挥着不可替代的作用,放疗可通过放射线杀灭恶性肿瘤细胞,不可避免会损伤恶性病变周围不含有肿瘤细胞的正常细胞。有研究表明行盆腔、腹部肿瘤放疗的患者,75%以上可发生不同程度的放射性损伤,其中急性放射性肠炎可见于四分之一到四分之三的患者,现有的药物、营养支持、对症等治疗方式对此病的治疗效果不佳,因此寻找一种有效的治疗途径十分重要,应用干细胞修复损伤组织为治疗急性放射病提供一种新的重要的方法。干细胞的具有很强的增殖能力,并且具有多向分化功能,对于维持机体的内环境稳定和受损伤组织的修复极为重要。因此,干细胞研究也逐渐成为生命科学及医学领域研究的热点。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)最初于骨髓中发现,可来源于自体或异体,可由骨髓、脐带等多种组织器官获取。MSCs在体内或者体外经诱导能分化为内皮细胞、骨细胞和脂肪细胞等。MSCs在体外可通过连续传代进行培养后,使其具有分化成为不同细胞的能力并得以保留。研究表明,骨髓来源的MSCs能准确的定位移植在损伤处并促进愈合。当腹部受到损伤辐射后,由于构成小肠肠壁的上皮细胞更新速度快,遇到电离辐射损伤时反应最为敏感。放射损伤可刺激MSC迁移到受损伤组织,促进该处组织修复及重建。研究发现一些细胞因子可起到抗辐射损伤的作用。本研究通过构建不同剂量下的比格犬急性放射性肠损伤模型,应用股动脉穿刺后行自体骨髓间充质干细胞移植以治疗犬急性放射性肠病,研究应用不同剂量照射前后及ABMSCs移植治疗后对比格犬的症状表现、内镜下特征及其肠功能进行分析,并采用蛋白芯片技术分析放射损伤前后及干细胞治疗后免疫因子表达的差异,为进一步明确干细胞治疗放射性肠病的机制研究及临床转化奠定基础。目的应用不同剂量的放射线照射比格犬用于构建急性放射性肠病损伤模型;采用ABMSCs移植的方法治疗不同剂量引起的急性放射性肠病,通过蛋白芯片技术对肠道损伤后及治疗后各种细胞因子表达差异进行分析,为急性放射性肠病的发生机制及干细胞治疗奠定理论及实践的基础。方法第一部分:建立放射性肠损伤比格犬模型。1、建立比格犬应用放射剂量性腹部损伤模型,将20只比格犬分别随机分为4组,每组纳入5只试验犬,分别命名为A、B、C、D组,将A组设为空白对照,B、C、D组分别应用10Gy、12Gy、14Gy的辐射剂量,剂量率为250c Gy,以调强照射的形式行腹部靶区放射。2、观察放射肠损伤前后比格犬的一般情况包括:体温、体重、进食、活动、呕吐、腹泻、便血及生存时间等方面。3、观察不同剂量放射性肠道损伤下的严重程度分度。将急性放射性肠道损伤按照以下标准进行严重程度的区分:1度:每日腹泻2-3次,粪便呈粗大状态,肠道出血方式为隐性出血,腹部可呈微弱的绞痛或者疼痛;2度:每日腹泻4-6次,排便呈松散状态,肠道出血方式为间歇式出血,伴有中度的腹部绞痛或疼痛;3度:每日腹泻7-9次,排便呈稀松稠度,肠道出血方式为持续出血,伴有强烈的腹部绞痛或疼痛;4度:每日腹泻大于10次,排便呈水样,肠道出血为持续大量出血,腹部呈极度绞痛或疼痛。4、应用D-木糖含量测定的方法检测放射损伤后肠道吸收功能。5、化验血DAO分析辐射后肠道的屏障功能变化情况。6、于肠道放射损伤前后给予行肠镜检查,观察不同剂量辐射下的放射性肠炎的内镜下表现情况。7.肠镜下取肠道粘膜组织活检,对肠道黏膜损伤情况进行评分,具体评分标准根据肠道黏膜损伤情况由0-4分表现,其中0分为正常组织,1分为黏膜损伤面积较小,2分黏膜损伤面积在50%以下,3分黏膜损伤面积≥50%,4分为粘膜完全损失。炎症细胞浸润如下:0分为无或轻微,1分为轻度炎细胞浸润,2分为中度炎细胞浸润,3分为重度炎细胞浸润,4分为极重度炎细胞浸润。血管充血程度:0分为无或轻微血管充血,1分为轻度血管充血,2分为中度血管充血,3分为重度血管充血,4分为极重度血管充血。将各项分数相加则为该组织的病理总评分。8.将肠道活检组织应用透射电镜扫描观察放射损伤前后肠道组织的电镜下表现情况。第二部分:应用充质干细胞移植治疗不同剂量照射组犬急性放射性肠病的疗效观察。1、用不同辐射剂量(10Gy、12Gy、14Gy)照射比格犬并建立急性放射性肠病的损伤模型,将35只试验用比格犬随机分为7组(分别定义为A、B、C、D、E、F、G组),平均每5只动物分成1组,其中A组作为空白对照组,B组为10Gy照射后生理盐水治疗组,C组是12Gy照射后生理盐水治疗组,D组为14Gy照射后生理盐水治疗组,E组是10Gy照射后干细胞治疗组,F组为12Gy照射后干细胞治疗组,G组是14Gy照射后干细胞治疗组。对比格犬实行腹部划区照射,方式采取调强照射,剂量采用不同组相对应的照射剂量,观察辐射损伤后、干细胞治疗后实验比格犬的症状表现、肠镜下特征、肠道功能改变、生存时间,并使用组织病理学评分的方法来评价放射损伤引起的肠道损伤程度的情况。2、ABMSCs的培养以及鉴定:首先选取在比格犬胫骨平台部位抽取骨髓,Percoll密度梯度离心后原代培养,于贴壁大约75%后,用含有EDTA的胰蛋白酶进行消化,后进行传代。标记细胞,所用表面标记物具有特异性,本实验中选取CD29、CD44、CD45、CD90进行,标记完成后进入鉴定阶段,应用两种方法,第一种为免疫荧光法鉴定,第二种为流式细胞分析法。对所取标本进行成骨诱导分化,所得结果经鉴定明确后进入下一阶段。3、ABMSCs移植:需要通过股动脉穿刺植入,穿刺过程在DSA成像技术辅助下完成,将已标记细胞植入肠系膜动脉内,该部分血管为放射性损伤肠段供血。4、确定移植干细胞定植、归巢:采用细胞膜染料CM-Dil标记联合DAPI染色确定干细胞定植于受损伤的肠道组织。5、将急性放射性肠道损伤按照标准进行严重程度的区分1—4度。6、症状表现:每日观察比格犬的体温、活动、食欲、呕血、粪便、体重情况。7、肠道功能检测:应用D-木糖含量测定肠道吸收功能;化验血DAO分析肠道的屏障功能。8、肠镜检查及肠镜下活检:对实验用比格犬分别取正常、照射后及治疗后的肠镜,保存肠镜检查的图片,留取肠道粘膜活检标本保存备用。9、对肠道黏膜损伤情况进行评分:具体评分标准根据肠道黏膜损伤情况由0-4分表现,分数越高则损伤情况越严重。炎症细胞浸润评分从无到极重度炎细胞浸润分别评分为0-4分。血管充血程度:从无或轻微血管充血到极重度血管充血分别评分为0-4分。10、观察记录各组实验动物的生存时间。11、应用透射电镜扫描观察各组肠道组织的电镜下表现情况。第三部分:间充质干细胞移植治疗犬急性放射性肠病的初步机制研究。1、将试验用18只比格犬随机分为3组,分别为正常对照组、生理盐水组、ABMSCs治疗组,每组含有6只犬。2、应用ABMSCs治疗组比格犬培养骨髓间充质干细胞:经由比格犬胫骨平台完成骨髓抽取,Percoll密度梯度离心并原代培养;当这些骨髓间充质干细胞贴壁大概80%左右后,采取含有EDTA的胰蛋白酶进行消化,传代、扩增。3、以12Gy辐射剂量采用调强照射的方式分别对ABMSCs治疗组、生理盐水组、比格犬进行单次腹部照射,形成12Gy剂量的放射性肠病的比格犬动物组。3、ABMSCs体内移植治疗:于照射后2天(48小时)行股动脉穿刺,在DSA成像技术辅助下进行移植,将所标记细胞移植在肠系膜动脉内,使培养的犬干细胞到达受支配肠段。4、对实验用比格犬分别取正常、照射后及治疗后的肠镜,留取肠镜检查图片及肠道活检样本,对各组分别留取正常、照射后及治疗后至少3份肠道组织样本,用于蛋白芯片检测。5、对待检测样本经蛋白芯片QAC-CYT-1检测蛋白GM-CSF、VEGF、IL-2、IL-10、MCP-1、IL-6、RAGE、SCF、IL-8、TNF-α;经蛋白芯片QAC-CYT-2检测蛋白Erythropoietin、FGF-7、HGF、HGFR、IFN-γ、IL-1β、IL-12p40、IL-17A、MIP-1β、TNF RI。6、组织样品的准备。7、蛋白浓度测定。8、芯片操作流程。9、使用相对应的软件对QAC-CYT-1和QAC-CYT-2的数据结果进行统计分析。10、对筛选出具表达差异的细胞因子进行生化实验验证。11、应用差异基因GO富集分析方法探寻相关的基因通路,为进一步研究骨髓间充质干细胞治疗放射性肠损伤的分子机制奠定基础。结果1、成功建立了三个不同照射剂量下的犬急性放射性肠病模型1、采用10Gy、12Gy、14Gy放射剂量照射比格犬,并建立了急性放射性肠病的损伤模型,通过症状表现、内镜检查及组织学变化的评估方法可见犬在不同放射剂量由低到高增高的过程中,放射性肠道损伤程度亦呈增高趋势(P=0.002)。显示了在放射剂量由弱到强的增高的过程中,比格犬各种不适症状表现出来的时间随剂量增大而呈正相关,主要症状为一般状态变差,进食较少,呕吐胃内容物和大便次数增多及大便中带血等,且症状重,持续时间长。2、肠镜检查结果提示由于辐射剂量不同,肠镜检查的结果也不同。采用肠镜对比格犬肠道损伤情况进行检查,发现损伤程度与照射剂量呈现正相关,照射剂量较小者往往表现为充血、水肿等症状,病情略微加重的可能出现点状出血及出血表现,呈现出弥漫性充血及片状出血的肠道粘膜多见较大剂量照射,最严重者肠道可能出现溃疡及出血。结肠镜下肉眼可见表现:在14Gy照射组内镜可见多灶性和弥漫性的充血、水肿,有的可见片状出血和糜烂及溃疡;12Gy照射组内镜下可发现较为明显的充血和水肿,还可见点状、小片状的出血;10Gy照射组可见肠道粘膜大致平滑,有轻度的充血或水肿。可见放射剂量由大到小,比格犬肠镜下表现由重到轻。3、对病变部位进行组织学检查,发现损伤程度与辐射剂量同样呈现正相关,辐射剂量相对较小者粘膜损伤程度较轻,8Gy照射后大多只是轻度病变,而10-12Gy照射后病变会随着剂量加大而加重,严重者可能出现出血等表现。4、肠道吸收功能:放射损伤组实验动物的血清D-木糖浓度相比对照组呈下降表现,受到辐射损伤的剂量越大,D-木糖浓度下降越明显。5、肠道屏障功能:放射损伤组比格犬血DAO浓度相比对照组升高,受到辐射损伤的剂量越大,DAO升高越明显。5、生存状况:在照射后40天的时间内,10Gy照射组比格犬无死亡发生。在12Gy照射组中,有3只于照射后40天内死亡。14Gy照射组中比格犬:5只于照射后40天内死亡。2、对比格犬骨髓间充质干细胞进行培养并鉴定由比格犬的胫骨平台抽取骨髓,分离后将细胞于培养瓶或培养皿中对间充质干细胞进行培养、换液;运用流式细胞仪进行标记分析CD29、CD44、CD90、CD45。通过细胞免疫荧光证实,并对骨髓间充质干细胞进行鉴定,进一步行传代,体外扩增。对获取的间充质干细胞,将细胞内加入成骨诱导液对细胞进行诱导分化,观察间充质干细胞变化,该实验可以证明间充质干细胞具有分化功能,可以最终形成多种细胞。采用细胞膜染料CM-Dil标记联合DAPI染色确定干细胞可以归巢及定植于受损伤部位肠道。3、对犬急性放射性肠病进行骨髓间充质干细胞移植治疗有效对10Gy、12Gy、14Gy建模的犬急性放射性肠病行干细胞移植治疗。干细胞治疗组治疗后比格犬症状表现改善明显,腹泻、便血减轻,体温升高较生理盐水对照组减轻,体重下降幅度减小,肠道吸收及屏障功能检测提示干细胞治疗后肠道功能恢复较快。根据肠镜下肠道组织病理活检,对各组分别于干细胞治疗前(放射照射后第2天)及治疗后(放射线照射后第9天)对组进行病理损伤评分,结果提示:10Gy组比格犬干细胞治疗前、后的炎症细胞浸润评分显著变化(P=0.034),治疗后该项评分下降明显;10Gy组病理评分的总分在干细胞治疗后显著降低(P=0.003);12Gy组比格犬干细胞治疗前、后炎症细胞浸润评分变化明显(P=0.003),治疗后该项评分下降;12Gy组病理总评分提示治疗后评分下降明显(P=0.005)。14Gy组干细胞治疗前、后病理损伤评分总分提示无显著差别(P>0.05)。电镜观察提示干细胞治疗组治疗后肠道粘膜恢复较好。比较各个剂量照射后生理盐水治疗组及干细胞治疗组的生存时间,Kaplan-Meier生存曲线提示:经12Gy腹部照射后应用干细胞治疗组比格犬的生存时间较没有应用干细胞治疗组比格犬的生存时间延长(P<0.05)。可见骨髓间充质干细胞移植治疗急性放射性肠病对12Gy剂量照射组的比格犬起到很好的疗效。4、应用蛋白芯片技术检测QAC-CYT-1、QAC-CYT-2因子,根据检测结果行差异基因GO富集分析可能的基因通路,探讨骨髓间充质干细胞治疗急性放射性肠病的相关机制所列单张芯片分析提示:放射损伤后2天生理盐水治疗组与正常(空白对照组)相比,差异性表达因子(Fold change选取大于2或小于0.5为差异性表达因子)如下:IL-2(Fold change=0),IL-6(Fold change=0),RAGE(Fold change=0),TNF-α(Fold change=0.040),MCP-1(Fold change=0.266)、GM-CSF(Fold change=0)、VEGF(Fold change=0.134)、SCF(Fold change=0.024)、IFN-γ(Fold change=0),IL-1β(Fold change=4.365),MIP-1β(Fold change=2.109)。治疗后7天干细胞治疗组与正常组织(空白对照组)相比,差异性表达因子为:IL-2(Fold change=0.130),RAGE(Fold change=0.002),IL-8(Fold change=935.046),TNF-α(Fold change=0.031),MCP-1(Fold change=16.724),GM-CSF(Fold change=0.128),VEGF(Fold change=0.0365)、IFN-γ(Fold change=0),IL-1β(Fold change=3.091),IL-12p40(Fold change=0.469)。干细胞治疗组比格犬于治疗后第7天与放射损伤后第2天相比,差异性表达因子为:IL-8(Fold change=750.675),MCP-1(Fold change=62.847),VEGF(Fold change=2.727),SCF(Fold change=22.322)、Erythropoietin(Fold change=0.119)。与正常组织相比,放射损伤后表达下调的细胞因子有:IL-2、IL-6、RAGE、TNF-α、MCP-1、GM-CSF、VEGF、SCF、IFN-γ,放射损伤后表达上调的细胞因子有IL-1β、MIP-1β。与损伤组织相比,干细胞治疗后表达下调的细胞因子有:Erythropoietin,治疗后表达上调的细胞因子有:IL-8、MCP-1、VEGF。与正常组织比,干细胞治疗后表达下调的细胞因子有:IFN-γ、IL-12p40,干细胞治疗后表达上调的细胞因子有:IL-8、MCP-1。芯片统计分析提示:治疗后第7天,与生理盐水治疗组相比,干细胞治疗组于表达上调并且具有统计学意义的细胞因子有:MCP-1(P=0.039)。应用Raybiothech ELISA检测试剂盒检测比格犬肠道中MCP-1的含量。结果统计分析提示:治疗后第7天,肠道中的MCP-1含量在生理盐水治疗组测得值为2839.20±63.03 pg/mg,在干细胞治疗组测得值为2988.20±80.41 pg/mg,两者相比较P=0.012,有统计学差异。经软件行各组比格犬肠道组织差异基因GO富集分析提示,最有可能参与放射性肠道损伤、干细胞修复的基因通路为Cytokine-cytokine receptor interaction、African trypanosomiasis通路、Malaria通路;最有可能参与干细胞治疗的基因通路为Cytokine-cytokine receptor interaction通路和Malaria通路。结论1、成功建立了不同放射剂量损伤下的比格犬急性放射性肠病模型,分析实验动物的症状表现、肠道功能变化、内镜下和组织学变化及生存时间等,提示随着辐射剂量的增大,包括精神萎靡、呕吐、腹泻、血便在内的系列临床症状出现的时间越早,症状越严重,病症持续时间越长。随着照射损伤剂量的增加,肠道功能变化明显,观察比格犬肠镜下损伤程度亦呈加重趋势,组织学变化更为明显;且生存时间会缩短。2、骨髓间充质干细胞经培养、传代、鉴定后,在DSA成像下经股动脉移植ABMSCs治疗比格犬急性放射性肠病,CM-Dil标记证实ABMSCs可归巢及定植于受损伤肠道。症状表现、肠道功能变化、内镜下和组织学变化均证实ABMSCs治疗组较生理盐水对照组各方面的改善更为明显。Kaplan-Meier生存曲线提示经12Gy腹部照射后应用干细胞治疗组比格犬的生存时间较没有应用干细胞治疗组比格犬的生存时间延长(P<0.05)。提示骨髓间充质干细胞移植治疗急性放射性肠病具有明显的治疗效果。3、应用蛋白芯片技术检测QAC-CYT-1、QAC-CYT-2因子,所列单张芯片结果提示:与正常组织相比,放射损伤后表达下调的细胞因子有:IL-2、IL-6、RAGE、TNF-α、MCP-1、GM-CSF、VEGF、SCF、IFN-γ,放射损伤后表达上调的细胞因子有IL-1b、MIP-1b。与损伤组织相比,治疗后表达下调的细胞因子有:Erythropoietin,治疗后表达上调的细胞因子有:IL-8、MCP-1、VEGF。与正常组织比,干细胞治疗后表达下调的细胞因子有:IFN-γ、IL-12p40,干细胞治疗后表达上调的细胞因子有:IL-8、MCP-1。芯片统计分析提示:与生理盐水治疗组相比,干细胞治疗后治疗后表达上调并且具有统计学意义的细胞因子有:MCP-1(P=0.039)。应用Raybiothech ELISA检测试剂盒检测治疗7天后肠道中的MCP-1含量在干细胞治疗组较生理盐水治疗组升高,在生理盐水治疗组测得值为2839.20±63.03 pg/mg,在干细胞治疗组测得值为2988.20±80.41 pg/mg,两者相比较P=0.012,有统计学差异。差异基因GO富集分析提示:Cytokine-cytokine receptor interaction通路和Malaria通路可能为参与放射损伤及干细胞修复的基因通路。