脐带间充质干细胞,是来源于脐带组织间质华通氏胶的一种具有多能性的干细胞。由于其免疫原性低,易于获得组织用于培养,也无伦理争议,逐渐成为干细胞研究领域的研究热点。同时,近年来外泌体的研究也在逐渐展开,其特殊的膜结构,可靶向标记的特性,正在不断应用于各项临床研究中。已有研究表明,脐带间充质干细胞及其外泌体,可以用于多种临床研究中,包括创伤愈合、脊髓损伤、术后康复、神经系统疾病、自身免疫性疾病等。但是,脐带间充质干细胞及其外泌体在肿瘤治疗中的作用和功能,及其分子机制仍不甚明了。本研究以脐带间充质干细胞及其外泌体作为研究对象,通过与肿瘤细胞共培养和仅用外泌体处理方式,观察对10个肿瘤细胞系的体外表型和体内生长特性的影响,并利用高通量测序技术分析基因表达的变化,进而阐明脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞的生物学功能和作用,为该技术临床治疗方面的应用提供实验基础。1.脐带间充质干细胞的分离培养和特性探究本章节中,成功分离培养脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测分析,显示高表达PE标记的CD73、CD90和CD105,几乎不表达FITC标记的CD11b、CD34、CD45和HLA-DR,符合干细胞表面抗原表达特性。可以定向诱导分化为:成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞,同时,使用两种β-巯基乙醇法都可以获得神经元样分化的细胞,表明其具备多向分化能力。在组织工程学应用探索中,脐带间充质干细胞不但可以与聚乳酸膜共培养,并且可以正常贴附和生长,表明它可以用于组织工程学。随后在增殖潜能探索中,使用表观遗传学的试剂处理,结果显示处理后有效地提高了细胞传代数和获取量,其中地西他滨5-Aza-2’-Deoxycytidine(DAC)最佳处理方案是1.25μM处理3h,曲古抑菌素TrichostatinA(TSA)最佳的处理方案是50ng/mL处理12h。综上,本研究分离获取的脐带间充质干细胞,符合间充质干细胞的生物学特性和标准,可以用于进一步的生物学和医学研究。2.脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定本章节通过无血清培养基培养本实验室自主分离的人脐带间充质干细胞,获取外泌体,并进行了鉴定。通过差速离心法和试剂盒提取法从上清提取间充质干细胞外泌体。使用透射电镜扫描,结果样本中都观察到典型杯帽状形态的外泌体。NTA粒径分析显示两种方法都获得的外泌体,都符合外泌体30～150nm粒径阈值特征。WB检测外泌体特征性表达蛋白,结果显示外泌体特异表达Tsg101、CD9和CD63蛋白,符合外泌体的特性。综上所述,本研究成功获得脐带间充质干细胞外泌体,可以用于进一步的实验研究。3.脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响在本章节中,采用了 Transwell插件共培养和直接添加外泌体两种方式处理肿瘤细胞,研究脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响。在体外细胞学实验中,本研究评价10种肿瘤细胞处理后的增殖、迁移、侵袭的能力,以及细胞周期的改变。结果显示,对于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7,都有促进增殖、迁移和侵袭,改变细胞周期的趋势,其中对MCF7迁移影响不显著;对于胃癌细胞系AGS和BGC-823,都有促进增殖、迁移和侵袭的趋势,其中对BGC-823细胞周期改变不显著;对人肠癌细胞系HCT116和SW480,都有促进增殖和侵袭,改变细胞周期的趋势,其中对HCT116迁移是抑制作用,SW480在共培养48h与对照组有显著差异;对于人肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2,都有促进增殖、迁移和侵袭的趋势,其中对SMMC-7721细胞周期改变不显著;对于人食管癌细胞系KYSE-150有促进增殖、迁移和侵袭,改变细胞周期的趋势;对于人肺癌细胞系A549有促进增殖和迁移,改变细胞周期的趋势,对侵袭影响不显著。筛选处理后肿瘤细胞表型特征改变明显,且成瘤性好的肿瘤细胞,用于裸鼠成瘤实验。结果显示,两种处理都不同程度促进肿瘤生长,其中对于食管癌细胞系KYSE150,干细胞共培养作用高于外泌体;对于胃癌细胞系AGS,外泌体处理对于促进肿瘤生长作用越来越显著,共培养则相反;对于肠癌细胞系HCT116两种处理趋势一致。综上,本研究获得了脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞影响的表型结果,其中HCT116表现出了促进增殖和侵袭,抑制迁移,改变细胞周期的表型。4.转录组测序检测脐带间充质干细胞及其外泌体对HCT116基因表达的影响在本章节中,本研究通过RNA-seq转录组测序技术,对肠癌细胞系HCT116进行基因表达检测和分析。首先,提取3个处理组细胞的RNA,即正常对照组HCT116、脐带间充质干细胞处理组HCT116-MSC、外泌体直接处理组HCT116-EXO,随后构建文库进行RNA-seq,并进行基因表达谱分析。数据分析分为三个组:HCT116-EXO相对于 HCT116,HCT116-MSC 相对于 HCT116,HCT116-EXO 相对于 HCT116-MSC。结果显示,3组分别筛选到1531个、186个和450个差异表达基因。进一步GO分析显示这些差异基因主要涉及的RNA转录调节、凋亡抑制、血管形成、厌氧反馈、细胞增殖、细胞迁移等生物学过程。同时,对这些差异基因KEGG富集分析结果显示这些基因被富集到轴突导向、白细胞跨内皮迁移、昼夜节律、IL-17信号通路、癌症中的MicroRNAs、HTLV-I感染、MAPK、细胞因子、Hippo、TNF、Rap1调节干细胞多能性的信号通路、p53等信号通路。在3个组别中,筛选出44个共表达的差异基因,进行GO和KEGG分析,结果显示这些基因集中于细胞厌氧反馈、细胞增殖、DNA复制、衰老、伤口反馈等生物学过程,富集于的破骨细胞分化、IL-17、癌症中的MicroRNAs、HTLV-I感染、糖尿病、HIF、缺氧诱导信号通路、细胞因子、p53等关键信号通路。进一步的利用String和Cytoscape进行差异基因的互作分析,发现BMP4、SERPINE1、JUN等基因,可能在脐带间充质干细胞及其外泌体对HCT116影响中起到关键作用。上述研究表明在HCT116细胞中,这些基因参与对细胞增殖、细胞迁移和细胞侵袭等相关通路调节,导致表型的改变。综上所述,本研究成功分离了脐带间充质干细胞及其外泌体。其对10种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭主要趋势是促进作用,同时都改变细胞周期。对HCT116细胞是促进增殖和侵袭,抑制迁移,改变细胞周期的作用。RNA-seq分析结果表明,脐带间充质干细胞及其外泌体处理HCT116后,筛选的差异基因涉及细胞厌氧反馈、细胞增殖、DNA复制、衰老、伤口反馈等生物学过程,影响了破骨细胞分化、IL-17、有碳代谢、癌症中的MicroRNAs、HTLV-I感染、糖尿病、HIF通路、缺氧诱导信号通路、细胞因子受体互作、线粒体自噬、p53等通路。通过String和Cytoscape对差异基因的互作分析,发现BMP4、SERPINE1、JUN等差异表达基因。