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目的 研究青藤碱(Alkaloid sinomenine,SIN)对人外周血CD4~+T细胞凋亡和P-ERK1/2及IL-2表达的体外影响,探讨SIN对人外周血CD4~+T细胞免疫抑制作用的效应和分子生物学机制,为临床应用SIN进行器官移植免疫治疗的提供理论依据。 方法 在衡阳市中心血站抽取三个健康人肘静脉血50ml,肝素(10U/m1)抗凝。用淋巴细胞分离液从血液标本中分离PBMC,并制成PBMC悬液。通过免疫磁珠分离法从PBMC悬液中分选CD4~+T细胞。将CD4~+T细胞用10%FCS RPMI-1640完全培养液在37℃、5%C02条件下培养。CD4~+T细胞经终浓度为5ug/ml的PHA和终浓度为100U/ml的IL-2扩增7天后,将扩增后的的细胞用PBS洗3遍,各组细胞培养液中加入终浓度为1ug/ml的抗CD3单克隆抗体,继续培养6小时后,各均分为6组细胞培养并作以下处理:(1)、Ⅰ组(空白对照组):细胞培养液中不加入任何药物;(2)、Ⅱ组(CsA组):细胞培养液中加入终浓度为50ng/ml的CsA溶液;(3)、Ⅲ组(低浓度SIN组):细胞培养液中加入终浓度为10umol/L的SIN溶液;(4)、Ⅳ组(中浓度SIN组):细胞培养液中加入终浓度为200umol/L的SIN溶液;(5)、Ⅴ组(高浓度SIN组):细胞培养液中加入终浓度为1000umol/L的SIN溶液;(6)、Ⅵ组(csA~+中浓度SIN组):细胞培养液中加入终浓度为50ng/ml的CsA溶液和终浓度为200umol/L的SIN溶液。继续培养24小时后,对各份细胞进行检测:1)、流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率;2)、Western blot法检测P-ERK1/2蛋白表达;3) ELLSA法检测IL-2表达。 结果 1、FCM检测CD4~+T淋巴细胞亚二倍体表达率(%):1) 对照组:1.70±0.30;2) CsA组:1.70±0.15;3) 低浓度SIN组:1.83±0.15;4) 中浓度SIN组:6.9±0.30;5) 高浓度SIN组:10.17±0.32;(6) CsA+中浓度SIN组:6.67±0.40。从结果可以看出:低浓度SIN组、中浓度SIN组、高浓度SIN组CD4~+T淋巴细胞亚二倍体表达率依次增高,中浓度组、高浓度SIN组及CsA+中浓度SIN组与对照组及