PEP4等位基因编码酵母蛋白酶A（PrA）。在营养胁迫、孢子形成和营养生长条件下,对酿酒酵母液泡蛋白水解系统是必须的。本文研究了PEP4等位基因对工业酿酒酵母菌株耐酸性的影响,构建了一个PEP4等位基因敲除型工业酿酒酵母菌株,并使用构建的DNA片段修饰衍生菌株的另一个PEP4等位基因。进而研究了PEP4等位基因对工业酵母在柠檬酸胁迫环境下的细胞生长和耐受性的影响。此外。本研究还对工业酿酒酵母菌株胞内PrA活性对柠檬酸胁迫耐受调节机制的途径进行了初步的研究。使用野生型酵母菌株SWY85作为起始菌株,构建菌株SWY85F（一个PEP4等位基因敲除型）和菌株SWY85S（第二个PEP4等位基因修饰型）。为了筛选携带Cre表达质粒的工业酿酒酵母转化体,我们将Sh ble编码序列赋予质粒p SH47以构建质粒p SH/Zeo,并使用构建得到的质粒转化一个PEP4等位基因受到敲除的酵母菌株,并诱导Cre重组酶的表达以拯救Kan MX筛选标记,以便于第二次PEP4等位基因修饰的转化子的筛选。为了确保同源重组位点不在同一个PEP4-等位基因上,我们构建了质粒p HR31,并使用构建的质粒为模板经PCR扩增得到的DNA片段转化酵母菌株SWY85F,并通过菌落PCR验证得到重组子菌株。对SWY85F和SWY85S两个菌株的柠檬酸胁迫耐受性和生长性能进行了研究。结果表明,第二个PEP4等位基因的修饰显著降低了菌株的胞内PrA的酶活性。对菌株在柠檬酸胁迫下细胞耐受性的比较分析显示,一个PEP4等位基因敲除型（SWY85F）菌株的细胞柠檬酸耐受性发生了显著降低,而第二个PEP4等位基因显著提高了菌株对柠檬酸胁迫的抗性。第二个PEP4等位基因修饰菌株（SW8Y5S）细胞内的海藻糖含量得到了显著的提高,同时发现,菌株SWY85S的胞内蛋白水平也受到了提高。