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[研究背景]关节软骨是覆盖骨头末端的高度专业化的组织,其能够使关节表面稳定且平滑地运动,并且同样重要的是,在生理条件下机械负荷的转移。软骨的细胞外基质(ECM)主要由透明软骨、含量丰富的胶原蛋白II和蛋白多糖组成,如聚集蛋白聚糖,层粘连蛋白,纤维连接蛋白等。SMOC(SPARC related modular calcium binding 2)位于人染色体6q27上,编码分泌型模块化钙结合蛋白2,属于BM-40/SPARC/骨粘连蛋白家族。SPARC蛋白家族的许多成员与骨骼系统的疾病有关。SMOC1是SPARC家族之一,与SMOC2高度同源,通过抑制BMP信号通路与骨质疏松症,胫骨和股骨缩短,肢体发育异常有关。SMOC2参与了骨骼发育过程。SMOC2基因突变可导致牙齿发育异常,颅骨异常和类风湿性关节炎。在骨祖细胞MC3T3-E1细胞中过表达SMOC2可以抑制成骨分化和细胞外基质矿化。此外,SMOC2参与肺、肝和肾的纤维化进展。SMOC2基因的敲除可以通过抑制NF-κB途径减轻纤维化的进展并减少炎症反应。[研究目的]鉴于上述背景,虽然SMOC2在骨骼发育中的重要作用得到证实,但没有学者报道过SMOC2在软骨细胞外基质中,是否存在和其它蛋白之间的相互作用以及对BMP通路的影响。为此我们制定了以下的研究目的:1.研究SMOC2与软骨细胞外基质其他成分之间的相互作用。2.分析SMOC2与BMP通路之间的关系。[材料和方法]1.获得了21天野生型小鼠的膝关节。将提取的组织蛋白用于Western Blot以检测SMOC2蛋白在各种组织中的表达。膝关节的石蜡切片用于免疫组织化学染色,以检测膝关节中SMOC2的表达。用免疫荧光染色确定SMOC2是否与其他软骨细胞外基质蛋白共定位。2.用人SMOC2-MYC慢病毒稳定转染HEK293T细胞。然后将其他软骨细胞外基质蛋白(例如BGN,FMOD,COL9A1等)的表达载体用PEI转染到稳定过表达SMOC2-WT-MYC细胞中。利用PLA实验和CoIP实验来分析SMOC2是否与这些蛋白质结合。3.构建仅含有SMOC2的EC结构域或FTST结构域(不含EC结构域)的慢病毒载体,并分别稳定转染到HEK293T细胞中。在与表达载体的其他ECM基因共转染后,通过使用PLA实验和CoIP实验来确定SMOC2与其他软骨ECM蛋白结合的结构域。4.使用从稳定的过表达SMOC2-WT-MYC细胞中提取的总蛋白进行Wester Blot,以分析SMAD1/5/9的磷酸化。将活化型BMP受体的表达载体(CaALK2、CaALK3或CaALK6)转染到上述细胞系中以分析SMAD1/5/9的磷酸化。用外源rhSMOC2刺激HEK293T细胞后,用RIPA缓冲液提取总蛋白,用Western Blot分析SMAD1/5/9的磷酸化。通过这种方式,确定了外源rhSMOC2对BMP途径的作用和机制。[研究结果]1.通过Western Blot和免疫组化染色,我们发现SMOC2在小鼠组织中广泛表达,并在膝关节和关节软骨的骨骺生长板增殖区中高表达。通过免疫荧光染色,我们发现SMOC2和BGN或FMOD共定位于关节软骨中。2.在共表达SMOC2和其他ECM基因的HEK293T细胞中,通过PLA测定鉴定SMOC2和BGN、FMOD、COL9A1和COMP之间的相互作用,并通过CoIP测定进一步证实。通过在稳定表达SMOC2的C28/12细胞中使用PLA实验证明SMOC2和HSPG2之间相互结合。3.对仅高表达EC结构域或FTST结构域以及分别有BGN、FMOD、COL9A1基质蛋白的HEK293T细胞系采用CoIP实验,发现SMOC2通过FTST结构域和BGN、FMOD结合;通过EC结构域和COL9A1结合。4.SMOC2高表达的HEK293T细胞中,SMAD1/5/9的磷酸化水平降低,提示SMOC2拮抗BMP信号通路;共转活化型BMP受体(CaALKO、CaALK3和CaALK6)的HEK293T细胞中,SMAD1/5/9的磷酸化水平升高,SMOC2对BMP信号通路的拮抗作用被拯救;外源性rhSMOC2刺激的HEK293T细胞中,低浓度的rhSMOC2使SMAD1/5/9的磷酸化水平升高,而高浓度的rhSMOC2使SMAD1/5/9的磷酸化水平降低。[研究结论]1.SMOC2参与软骨细胞外基质的组成,与多种ECM蛋白具有相互作用。SMOC2与MATN3、COMP、HSPG2相互结合,通过FTST结构域和BGN或FMOD相互结合;通过EC结构域和COL9A1结合。2.高表达SMOC2的HEK293T细胞中,SMAD1/5/9的磷酸化水平降低,BMP通路受到抑制。转染激活型受体CaALK2(ACVR1)、CaALK3(CaBMPRI A)和CaALK6(CaBMPR I B)以及之后,SMAD1/5/9的磷酸化水平上升,SMOC2对BMP通路的抑制被拯救,提示SMOC2可能通过竞争结合BMP受体发挥对BMP通路的抑制作用,而不是作用于受体的下游。3.低浓度的外源性rhSMOC2,可与BMP2竞争结合其它ECM蛋白,释放出BMP2与BMP受体结合,从而激活BMP通路;而高浓度的rhSMOC2则与BMP2竞争性结合BMPR I B,从而起到对BMP通路的抑制作用。