急性心肌梗死是危害人类健康的主要疾病之一。心肌梗死患者受损的心肌不能完全修复,导致具有收缩功能的心肌细胞减少,最终发展为心力衰竭。目前对心肌梗死的一些治疗手段如冠状动脉旁路移植术,只能恢复再灌注,而不能逆转已坏死的心肌,寻找可替代死亡心肌细胞的移植物治疗心肌梗死是近年来研究的热点。随着组织工程的兴起和迅猛发展为组织或器官缺损的修复重建带来了新的治疗途径,通过细胞移植的方法修复心肌梗死患者的心肌细胞,是一种极具有应用前景的治疗手段。自2001年Zuk等发现脂肪中存在脂肪间充质干细胞(adipose-derived stromal/stem cells, ASCs)以来,在人、小鼠、大鼠和兔等多个物种上的研究证明其具有体外分化为多种细胞表型的能力。脂肪组织与骨髓相比,具有易分离,干细胞含量高等优点,在体外培养条件下,ASCs也比BMSCs具有更高的增殖速率,因此其有望成为未来细胞/基因治疗和组织工程的主要种子细胞来源之一。本研究以12日龄SD大鼠为试验动物,采集腹股沟脂肪组织,胶原酶消化法获得ASCs,培养在生长培养基。利用SQ RT-PCR和免疫细胞化学染色等细胞生物学和分子生物学试验技术鉴定了将大鼠ASCs培养在RPMI1640生长培养基向心肌细胞分化能力,为自体干细胞移植治疗心肌梗死提供理论基础和试验依据。1、大鼠脂肪间充质干细胞的分离与培养从大鼠脂肪组织中分离提取SVF,并通过传代纯化获得ASCs。试验证明,经过体外多次传代以后,ASCs仍可保持干细胞的特性,并有较好的体外扩增能力。ASCs能够表达间充质干细胞的表面标记CD44和CD105,而不表达造血干细胞的标记CD34和CD106,也不表达成纤维细胞表面标志HLA-DR。2、脂肪间充质干细胞体外自发分化成心肌细胞将SD大鼠ASCs,培养于RPMI1640生长培养基中,倒置相差显微镜观察细胞形态发现,随着培养时间的延长,细胞形态趋向于心肌细胞,采用SQ RT-PCR、免疫细胞化学、免疫荧光染色和Western blot检测,表达心肌相关基因:β-肌球蛋白重链(β-MHC)、α-肌球蛋白重链(α-MHC)、心房利钠肽(ANP)、心肌肌钙蛋白(cTnT)、GATA-4、心肌肌动蛋白(α-cardiac actin)和肌细胞增强因子(MEF2C);表达心肌细胞标志蛋白:结蛋白(desmin)、横纹肌辅肌动蛋白(sarcomericα-actinin)、心肌肌动蛋白(α-cardiac actin)和间隙连接蛋白45(connexin 45);检测到心肌特异性蛋白Nkx2.5表达。结果显示:大鼠ASCs在体外培养条件下能自发分化成心肌样细胞,但未见搏动。3、心肌特异性基因Nkx2.5表达质粒载体的构建采用SQ RT-PCR方法从大鼠心脏组织的总cDNA中克隆出大鼠的Nkx2.5基因的OFR区,利用基因重组技术将Nkx2.5基因的OFR片段插入真核表达载体pcDNA3. 1,Lipofectamine2000包裹。酶切和测序鉴定正确后,经脂质体2000包裹转染入ASCs细胞,24h和72h后,提取转染细胞总RNA和蛋白,SQ RT-PCR检测证明Nkx2.5在真核细胞中表达,表明质粒表达载体pcDNA3.1-Nkx2.5构建成功。4、心肌特异性基因Nkx2.5重组腺病毒的构建将克隆出的大鼠Nkx2.5基因ORF区插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,获得pAdTrack-CMV-Nkx2.5重组穿梭载体。经酶切和测序鉴定正确后用Pme I线性化,在含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌细胞中同源重组获得pAdEasy-CMV- Nkx2.5。抽提重组体DNA,经Pac I酶切回收后以脂质体法转染人胚肾细胞株HEK293细胞,包装出完整腺病毒pAd-CMV-Nkx2.5,PCR检测显示重组腺病毒中含有Nkx2.5片段。应用荧光计数试验测定病毒滴度分别为6×10~8 pfu/ml。综上所述,(1)大鼠ASCs在体外培养条件下能够分化成心肌样细胞,在组织工程学及干细胞移植领域有着良好的应用前景。(2)成功构建了心肌特异性基因Nkx2.5的两个真核表达载体。