研究目的及背景:Dicer属于RNase Ⅲ核糖核酸内切酶家族,是microRNA加工过程的不可或缺的关键分子,对microRNA的功能发挥起重要作用。Dicer通过对microRNA的生成与功能调控而参与调节多种基因的表达,调节生物体的生长、发育、成熟、衰老等生理病理过程。凋亡细胞的异常清除可导致系统性自身免疫疾病,并与细胞因子风暴发生相关。巨噬细胞在凋亡细胞吞噬清除中起着重要作用,巨噬细胞及时清除凋亡细胞,可防止潜在的炎性和免疫原性内容物释放,避免体内出现自身抗原特异性T细胞活化,破坏自身免疫耐受,造成系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫疾病的发生。因此,凋亡细胞的有效清除在机体维持免疫稳态,避免慢性炎症和自身免疫病变的发生中发挥着关键作用。中医药干预SLE病变已有大量研究,中医药在临床应用上能有效改善病理指征,降低SLE标记物,结合西药治疗,能提高疗效,降低毒副作用。通过小鼠模型实验探索中医药对SLE分子生物学发病机制的影响,发现中医药可以广度改善SLE的发病相关通路及靶标,但采用中医药调控巨噬细胞清除凋亡细胞,以此干预SLE的发病机制的研究仍有待深入探索。有研究表明巨噬细胞Dicer参与调控巨噬细胞功能极化,microRNA可通过靶向不同基因调控巨噬细胞吞噬功能,这提示Dicer可能参与调控巨噬细胞清除凋亡细胞。我们的研究旨在观察Dicer对巨噬细胞清除凋亡细胞的调控作用,以及对免疫耐受的影响,探寻巨噬细胞调控凋亡细胞清除及免疫耐受的机制。筛选中药单体以调控巨噬细胞Dicer表达及吞噬能力,进而为中医药参与凋亡细胞清除和相关免疫功能提供新的机制与治疗方向。研究方法:1.通过RT-PCR及Western blot检测骨髓来源巨噬细胞及腹腔巨噬细胞吞噬凋亡细胞后Dicer的mRNA及蛋白水平变化;检测腹腔巨噬细胞吞噬凋亡Jurkat细胞,凋亡中性粒细胞后Dicer表达;检测凋亡细胞条件培养基对腹腔巨噬细胞Dicer表达的影响;采用细胞松弛素D抑制腹腔巨噬细胞吞噬过程,再检测凋亡细胞对腹腔巨噬细胞Dicer表达;体内实验部分,检测尾静脉注射凋亡细胞24小时后脾脏巨噬细胞Dicer表达,检测腹腔注射凋亡细胞12小时后腹腔巨噬细胞Dicer表达。以确定凋亡细胞清除对巨噬细胞Dicer表达的影响。2.激光共聚焦观察WT小鼠与Dicer-cko（髓样细胞Dicer敲除）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的差异;流式检测WT小鼠与Dicer-cko小鼠骨髓来源巨噬细胞,腹腔巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的差异;体内实验部分,检测尾静脉注射凋亡细胞2小时后脾脏巨噬细胞吞噬差异,检测腹腔注射凋亡细胞1小时后腹腔巨噬细胞吞噬差异;地塞米松诱导小鼠体内胸腺凋亡后,称重胸腺重量,流式检测胸腺凋亡率及CD68巨噬细胞比例;流式检测10周龄及60周龄WT小鼠与Dicer-cko小鼠骨髓及脾脏内的中性粒细胞凋亡率;RT-PCR检测WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬凋亡细胞后的炎症因子表达;流式检测WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬凋亡胸腺细胞后的炎症因子含量。以明确巨噬细胞Dicer对凋亡细胞吞噬的影响3.取8-10周龄的WT小鼠与Dicer-cko小鼠,注射巯基乙酸72小时后提取腹腔巨噬细胞,6孔板内贴壁,加入5倍于巨噬细胞的凋亡胸腺细胞,共孵育24小时,Trizol提取RNA,送检进行RNA seq,差异倍数>1.5,P<0.05为差异基因筛选参数;采用Gene Ontology富集分析,观察Dicer分子生物效应机制;通过KEGG富集Pathway,观察Dicer对机体生理,病理进程的综合影响。通过查找数据库及阅读文献,对差异基因功能分类,绘制热图;以了解巨噬细胞Dicer调控凋亡清除的相关机制;4.培养E.G7 OVA细胞,采用顺铂诱导细胞凋亡;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞,加入5倍于巨噬细胞的凋亡E.G7 OVA细胞,流式检测吞噬差异;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞在LPS存在条件下,加入5倍于巨噬细胞的凋亡E.G7 OVA细胞刺激24小时,HBSS洗三次,加入CFSE标记的OT-2 CD4 T细胞,72小时后流式检测CD4增殖情况;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞在LPS存在条件下,加入可溶性OVA刺激24小时,HBSS洗三次,加入CFSE标记的OT-2 CD4 T细胞,72小时后流式检测CD4增殖情况;WT小鼠与Dicer-cko注射巯基乙酸48小时后,尾静脉注射CFSE标记的OT-2 CD4 T细胞,待24小时后腹腔注射凋亡E.G7 OVA细胞,待72小时后流式检测小鼠脾脏内CD4增殖情况。以确定巨噬细胞Dicer对T细胞应答的影响。5.ELISA检测10周龄及60周龄WT小鼠与Dicer-cko小鼠血清ANA,ADA;记录60周龄WT小鼠与Dicer-cko小时24小时尿量,采用比色法检测尿液及血清的尿素氮,尿蛋白,肌酐含量;流式检测血清的细胞因子含量;免疫组化HE染色,观察小鼠肾脏,肺脏,皮肤的炎性浸润;免疫荧光C3染色观察小鼠肾脏经典补体的沉积;TUNEL染色检测脾脏细胞凋亡。以观察Dicer-cko老龄鼠的自身免疫系统病变。6.CCK8检测槲皮素,姜黄素,黄连素,白藜芦醇,甘草酸,穿心莲内酯的细胞活力,GraphPad Prism计算不同中药单体的EC50浓度;依照EC50浓度刺激WT小鼠腹腔巨噬细胞24小时,RT-PCR检测Dicer;选取诱导巨噬细胞Dicer上调最显著的中药单体刺激巨噬细胞,运用流式检测重复确定其对表达的影响。之后检测该中药单体刺激腹腔巨噬细胞后,加入凋亡胸腺细胞,流式检测吞噬。以此筛选能调控巨噬细胞Dicer,并影响巨噬细胞吞噬功能的中药单体。结果:1.骨髓来源巨噬细胞及腹腔巨噬细胞吞噬凋亡细胞后Dicer表达随着刺激时间逐渐上升;腹腔巨噬细胞吞噬凋亡Jurkat细胞或凋亡中性粒细胞后Dicer mRNA表达上升;凋亡细胞条件培养基不能刺激腹腔巨噬细胞Dicer表达改变;抑制巨噬细胞吞噬过程,凋亡胸腺细胞不影响腹腔巨噬细胞Dicer变化;尾静脉注射凋亡胸腺细胞,脾脏巨噬细胞Dicer mRNA表达上升;腹腔注射凋亡胸腺细胞,腹腔巨噬细胞Dicer mRNA表达上升。2.激光共聚焦显示Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞吞噬比例下降;流式检测Dicer-cko小鼠骨髓来源巨噬细胞,腹腔巨噬细胞吞噬率均低于WT对照;尾静脉注射凋亡胸腺细胞,脾脏巨噬细胞吞噬率下降;腹腔注射凋亡胸腺细胞,腹腔巨噬细胞吞噬率下降;小鼠注射地塞米松后,Dicer-cko小鼠胸腺重量,胸腺凋亡率均高于WT小鼠,CD68巨噬细胞比例基本相同;10周龄及60周龄WT小鼠与Dicer-cko小鼠骨髓中性粒细胞凋亡率无明显差异,Dicer-cko小鼠脾脏内的中性粒细胞凋亡率更高,随着年龄凋亡率呈上升趋势;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬凋亡胸腺细胞后的炎症因子表达结果为Dicer-cko小鼠巨噬细胞TNF-α,IL-6,IL-1 β分泌上升。WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞体内吞噬凋亡胸腺细胞后,Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞的分泌IFNγ,TNF-α,IL-9,IL-13,IL-22上升。3.RNA seq结果,筛选差异倍数>1.5,P<0.05的差异基因,得到208个差异基因,其中上调基因51个,下调基因157个;采用Gene Ontology富集分析,分子功能（molecular function）富集 12 个 G0 条目、细胞组分（cellular component）富集18个GO条目、参与生物过程（biological process）富集27个GO条目,共计57个GO term。通过KEGG富集分析,共富集到179个Pathway,这些主要集中于人类疾病,机体系统,细胞进程,环境信息传导,代谢等KEGG A级Pathway中。通过查找数据库及阅读文献,确定差异基因的生物功能作用,发现差异基因的功能主要集中于调节或参与吞噬,炎症,代谢生理过程这三大类。4.WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞吞噬凋亡E.G7 OVA细胞,Dicer-cko吞噬率更低;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞在LPS存在条件下吞噬凋亡E.G7 OVA细胞后,Dicer-cko组OT-2 CD4增殖率更高;WT小鼠与Dicer-cko小鼠腹腔巨噬细胞在LPS存在条件下摄取可溶性OVA后,OT-2 CD4 T细胞均出现明显增殖,但Dicer-cko组更明显。WT小鼠与Dicer-cko小鼠输入OT-2 T细胞,再腹腔注射凋亡E.G7 OVA细胞,脾脏内OT-2 CD4 T细胞均出现明显增殖,但Dicer-cko组更显著。5.10周龄及60周龄WT小鼠与Dicer-cko小鼠血清ANA,ADA表达,仅60周龄Dicer-cko小鼠出现病理性上升;肾功能检测结果显示60周龄的Dicer-cko小鼠肾功能失常;60周龄Dicer-cko小鼠外周血血清中炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-9均高于WT组;免疫组化HE染色显示Dicer-cko小鼠肾脏,肺脏及皮肤中出现明显炎症性浸润;免疫荧光C3染色显示60周龄Dicer-cko小鼠肾脏中C3补体沉积明显高于WT对照,;TUNEL染色脾脏Dicer-cko小鼠显示更多的凋亡细胞。6.CCK8检测中药单体对巨噬细胞的EC50浓度为,姜黄素32uMOL,黄连素17uMOL,槲皮素88uMOL,穿心莲内酯29uMOL,白藜芦醇138uMOL,甘草酸134uMOL。;根据EC50浓度刺激WT小鼠腹腔巨噬细胞24小时,姜黄素诱导巨噬细胞Dicer表达上调最显著,流式检测可以观察到Dicer明显上调;姜黄素刺激WT小鼠腹腔巨噬细胞后,加入凋亡胸腺细胞,吞噬率高于空白对照组,对Dicer-cko组无影响。结论:1.巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬可诱导自身Dicer表达上升;2.巨噬细胞Dicer缺失降低了其清除凋亡细胞能力;3.Dicer可调控巨噬细胞多种基因表达,而调控凋亡细胞清除;4.巨噬细胞Dicer参与调控凋亡细胞相关自身抗原的免疫应答;5.小鼠巨噬细胞Dicer缺失可导致系统性红斑狼疮样病变;6.姜黄素可促进巨噬细胞Dicer表达,提高巨噬细胞吞噬凋亡细胞功能。