论文部分内容阅读
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GAB A)具有多种生理活性功能,以益生菌乳酸菌进行GABA的微生物发酵具有广泛的应用前景。为快速、高效的测定GABA的含量,基于Berthelot反应,本实验采用酶标仪法测定GABA含量并对影响该方法的主要因素进行优化。确定了在测定GABA的适宜反应体系中0.2mol/L pH10.0硼酸盐缓冲液为0.75mL,6%的重蒸苯酚为2.5mL,有效氯5.2%的NaClO溶液为2mL时,酶标仪测定可获得较高的GABA含量,同时进行了精密度试验。最后,通过对诱变后的75株突变株经96孔板发酵后,分别使用分光光度计与酶标仪测定发酵液中GABA的含量并进行拟合,以验证该方法的可行性。得出两种方法的相关系数R=0.9493,显示两种测定方法具有很好的一致性。本实验结果表明酶标仪法能简便、快速、准确地测定发酵液中GABA的含量,为后续高通量选育GABA乳酸菌奠定了基础。本实验以HX-3-6为出发菌株,120s为最适诱变时间,利用梯度平板对经ARTP诱变后的突变株进行初步筛选,从而建立一种初筛机制,即：对GABA浓度较高梯度处的突变株进行挑选,GABA浓度较高处且菌落相对较大的菌株GABA的产生能力偏高。经初筛后,采用96孔板发酵复筛,通过对诱变后的50株突变株,分别经三角瓶发酵以及96孔板发酵,验证两方法之间的相关性,得出两种方法的相关系数R2=0.9931,显示两种方法具有很好的一致性,证明96孔板发酵可以用于产GABA乳酸菌的大批量复筛,采用建立的初筛以及复筛方法,大大提高了筛选效率。按照建立的初筛以及复筛方法进行筛选,最终获得一株突变株L-120-1, GABA的产量可达到6.322g/L,较诱变前初始菌株HX-3-6的产量提高22.49%。并经过多次传代产量稳定。本实验采用孔板法,对孔板法发酵产GABA的条件进行优化。首先对48孔板与96孔板的发酵进行了比较,确定使用96孔板,然后对孔板发酵的装液量、接种量、碳源、氮源、L-谷氨酸(L-Glu)的添加量进行了单因素优化。利用Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计对培养基组分进行进一步优化,得出其最佳浓度,结果表明,优化得到4种显著因子葡萄糖、玉米浆、L-Glu、以及发酵时间分别为8g/L、 9.2g/L、3.6%、70h。采用优化培养基的产量可达到12.84g/L,较原始培养基的产量增加了6.52g/L。同时,对三角瓶发酵产GABA的条件进行优化,首先对发酵的装液量、接种量、碳源、氮源、L-Glu的添加量进行了单因素优化,在单因素基础上,利用Plackett-Burman得出对产GABA影响最大的因素分别为：葡萄糖、玉米浆、接种量以及发酵时间,优化得到4种显著因子葡萄糖、玉米浆、接种量以及发酵时间通过响应面优化后的结果分别为22.0g/L、15.0g/L、19%、48h。采用优化培养基GABA的产量可达到12.030g/L,较原始培养基GABA的产量增加了5.602g/L。对突变株进行3L发酵罐的放大发酵,发现pH以及谷氨酸钠对GABA的产量影响较大,因此,采用控制发酵过程的pH以及分批流加谷氨酸钠的方法,使GABA的积累量达到19.813g/L,比不经过任何调控发酵的GABA的积累量增加57.8%。