电针(electroacupunc ture,EA)是将针灸针连接到一个电脉冲发生器上,将针灸和电刺激相结合,通过电脉冲刺激针灸穴位的方法,来达到良好的疗效,电针相对于传统针刺而言,其疗效的一致性更好,其可重复性也更佳,具有科学性等优点,因此也更常用于临床和基础研究中.足三里穴是足阳明胃经的主穴,具有调理脾胃、补中益气的功能,而电针足三里穴改善胃肠道功能障碍性疾病和围术期肠功能障碍等的研究越来越受到当今医学研究的重视.小动物活体成像技术因其具有无创、连续监测和活体检测的优点,堪称是分子基因检测领域的革命性技术,作为一项新兴的分子、基因表达的分析检测技术,已成功应用于生命科学、生物医学、分子生物学和药物研发等领域.阿片受体作为阿片肽类物质功能活动的中间信使广泛分布于胃肠道,其中μ阿片受体(MORs)的分布要明显多于其它阿片受体.近年来,已有应用分子生物学技术合成携带μ受体的增强型绿色荧光蛋白pIRES2载体质粒即MORs-pIRES2-EGFP质粒的报道.而目前国内外关于胃肠MORs活性的研究,并未涉及活体的研究,本研究旨在通过裸鼠活体状态下研究MORs-pIRES2-EGFP在胃肠的分布来初步探讨电针对胃肠MORs活性的影响及作用机制.　　目的：1.构建小鼠MORs-pIRES2-EGFP质粒并验证其成功.　　2.构建通过小鼠MORs-pIRES2-EGFP质粒尾静脉注射转染,通过IVIS LuminaXR活体成像图谱分析研究MORs-pIRES2-EGFP分布的模型.　　3.通过阑尾切除术裸鼠术前、术后,电针足三里刺激干预后,活体成像图谱分析,明确围术期胃肠MORs-pIRES2-EGFP分布的变化和电针对MO Rs-pIRES2-EGFP分布的影响.　　4.研究围术期电针足三里穴对大鼠胃肠纵形肌条收缩功能的影响.　　方法：1、通过提取小鼠脑组织总RNA,并进行扩增,克隆至载体中,经酶切连接克隆入PIREs2-Egfp中,而测序结果表明MORs-pIRES2-EGFP质粒构建成功.在荧光显微镜下,转染细胞可以通过高分辨率荧光显微镜观察到绿色荧光.　　2、通过提取小鼠脑组织总RNA,并进行扩增,克隆至载体中,经酶切连接克隆入PIREs2-Egfp中,而测序结果表明MORs-pIRES2-EGFP质粒构建成功.在荧光显微镜下,转染细胞可以通过高分辨率荧光显微镜观察到绿色荧光.　　3、24只裸鼠随机数字表法分为4组,每组6只,实验分组：A组(对照组),B组(手术造模组),C组(手术造模+假电针组),D组(手术造模+电针组).A组裸鼠水合氯醛麻醉腹腔内注射麻醉,不进行手术操作.B组麻醉过程同A组,在麻醉完善后进行手术造模,行阑尾切除术.裸鼠麻醉后,D组(手术造模组+电针组)电针时取裸鼠双侧足三里穴,应用电针刺激治疗仪以疏密波、密波100Hz/s和疏波5Hz/s交替,刺激强度约为1mA.以裸鼠后肢轻轻抖动但能耐受为宜.每次电针持续30min,2次/d,连续3d.假电针组即操作步骤相同,但不进行通电刺激.将纯水、10%GS、转染试剂和MORs-pIRES2-EGFP质粒按说明书要求配置成100μL的转染复合物.B组(手术造模组)在阑尾切除术前(T0),阑尾切除术后0.5h(T1)、(T2)、1h(T3)、2h(T4)、4h(T5)和6h(T6)不同时点,C组(手术造模组+假电针组)和D组(手术造模组+电针组)在电针开始前(T0)和电针后0.5h(T1)、1h(T2)、2h(T3)、4h(T4)和6h(T5)不同时点行IVIS LuminaXR活体成像.A组(对照组)的时间点是同步于B组、C组和D组,行活体成像.各组裸鼠在3天后均过量麻醉处死,取胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠的肠粘膜,放入10%福尔马林溶液中保存,HE染色并制备胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠的组织切片,　　4、成年SD雄性大鼠30只随机分为5组,每组6只,实验分组：A组(正常对照组),B组(电针组),C组(手术造模组),D组(手术造模+电针组),E组(手术造模+假电针组).大鼠麻醉后,造模组行阑尾切除术.A组不做任何操作,C组仅行阑尾切除术,B组和D组行双侧足三里电针,一天一次,E组则于大鼠双侧足三里穴插上针灸针不通电,一天一次,连续7天后取十二指肠、空肠、回肠、胃体和胃窦的纵形肌肌条.　　结果：1.经酶切鉴定所合成的MORs-pIRES2-EGFP质粒,而测序结果表明MORs-pIRES2-EGFP质粒构建成功.Mors-PIRES2-EGFP转染至HEPG2细胞,用高分辨率荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白表达,提示转染效率较高.　　2.各组裸鼠不同时点活体成像荧光表达的对比：D组裸鼠在电针前(T0),荧光信号较弱,胃肠MORs-pIRES2-EGFP质粒分布较少,但在电针后0.5h(T1)荧光信号明显增强,胃肠MORs-pIRES2-EGFP质粒分布明显增多.而在电针后1h(T2)、2h(T3)和4h(T4),荧光信号逐渐减弱,在电针后6h(T5)则基本恢复到电针前状态.C组裸鼠在假电针前(T0),胃肠MORs-pIRES2-EGFP分布较少,荧光信号较弱,而在假电针后1h(T2)、2h(T3)荧光信号稍有增强,但明显弱于D组,假电针后4h(T4)和6h(T5)逐渐恢复到假电针前(T0)状态.B组裸鼠在阑尾切除术前(T0)在胃肠见到强荧光表达信号,说明胃肠MORs-pIRES2-EGFP术前在胃肠有分布,阑尾切除术后0.5h(T1)、(T2)、1h(T3)、2h(T4)、4h(T5)和6h(T6)各时点则荧光信号明显减弱.A组在T0、T1、T2和T3时点,胃肠均可见到较强荧光表达信号,而在T4和T5时点则明显减弱,考虑可能与MORs-pIRES2-EGFP质粒在体内的代谢有关.　　3.裸鼠活体成像表达面积比较：与T0比较,D组裸鼠活体成像荧光表达面积在T1、T2、T3和T4时点均明显增大,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05).与T0比较,C组裸鼠活体成像荧光表达面积在T1、T2和T3时点均明显增大,差异有统计学意义(P<0.05).与T0比较,B组裸鼠活体成像荧光表达面积在T1、T2、T3、T4和T5时点均明显减小,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.05).与T0比较,A组裸鼠活体成像荧光表达面积在各时点差异无统计学意义(P>0.05).　　4.裸鼠活体成像发光子数比较：与T0比较,D组裸鼠活体成像荧光发光子数在T1、T2、T3和T4时点均明显增大,差异有统计学意义(P<0.01).与T0比较,C组裸鼠活体成像荧光发光子数无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05).与T0比较,B组裸鼠活体成像荧光发光子数在T1、T2、T3、T4和T5时点均明显减小,差异有统计学意义(P<0.01).与T0比较,A组裸鼠活体成像荧光荧光发光子数在T4和T5时点少于T0时点,差异有统计学意义(P<0.05).　　5.裸鼠麻醉状态下取出小肠时活体成像与将小肠回纳后的活体成像对比：在麻醉状态下裸鼠将小肠取出放置于腹部时,可见在小肠表面有荧光表达信号,而在小肠回纳入腹部并缝合腹腔后仍然看到小肠向体表投射的荧光表达信号,并且强度相似.　　6.光镜下观察(×400倍),胃、空肠、十二指肠、回肠和结肠腺体规则,细胞未见明显异形,细胞核位于基底部,可见调亡现象,间质毛细胞血管稍扩张充血,周围散在少量淋巴细胞及中性粒细胞,少量嗜酸性粒细胞.粘膜层、粘膜下层、肌层和浆膜层结构存在.　　7.电针的促胃肠动力作用,D组(手术造模+电针组)十二指肠纵形肌肌条的振幅明显强于C组(手术造模组),差异有统计学意义(P﹤0.05),而E组(手术造模+假电针组)十二指肠纵形肌肌条的振幅明显弱于D组(手术造模+电针组),差异有统计学意义(P﹤0.05);C组(手术造模组)空肠纵形肌肌条的振幅明显弱于A组(对照组),差异有统计学意义(P﹤0.05),同时也弱于B组(电针组),差异有统计学意义(P﹤0.05);B组(电针组)回肠纵形肌肌条的振幅明显强于A组(对照组),差异有统计学意义(P﹤0.05),同时也强于C组(手术造模组),差异有统计学意义(P﹤0.01),强于D组(手术造模+电针组),差异有统计学意义(P﹤0.01),也强于E组,差异有统计学意义(P﹤0.01);C组(手术造模组)胃体纵形肌肌条的振幅明显弱于B组(电针组),差异无统计学意义(P=0.05);各组胃窦纵形肌肌条的振幅比较,差异无统计学意义(P>0.005).　　8.各组胃肠纵形肌肌条收缩波频率的比较,E组大鼠胃体纵形肌肌条收缩波频率高于C组,差异有统计学意义(P<0.05);各组大鼠十二指肠、空肠、回肠、胃窦的胃肠纵形肌肌条收缩波频率组间比较,差异无统计学意义(P>0.05).　　结论：1.通过PCR等技术可成功构建MORs-pIRES2-EGFP质粒,并且MO Rs-pIRES2-EGFP质粒可转染到细胞中,通过荧光显微镜可观察到绿色荧光.　　2.通过小动物活体成像可观察到MORs-pIRES2-EGFP质粒在裸鼠胃肠的分布情况.电针可促进围术期裸鼠MORs-pIRES2-EGFP质粒在胃肠的分布.　　3.电针刺激对大鼠十二指肠纵形肌的作用比只针刺而不通电刺激要强.电针刺激可增强大鼠回肠和胃体纵形肌肌条收缩振幅.　　4.阑尾切除术可减弱大鼠空肠纵形肌收缩的振幅.电针刺激和阑尾切除术对大鼠十二指肠、空肠、回肠、胃窦的纵形肌肌条收缩波频率变化并没有明显影响.