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研究背景双酚A(Bisphenol A,BPA)作为一种重要工业原料,在世界范围内被广泛生产与使用。BPA主要被用来当做塑料制品添加剂,并广泛存在于罐装食品,奶瓶,水瓶,密封胶,眼镜等日常用品中。在加热或者遇到酸时,BPA会从塑料等制品中释放出来,导致人类的广泛暴露。BPA是一种典型的环境内分泌干扰物,具有较弱的雌激素效应。近年来,流行学研究和动物实验研究均报道BPA暴露与肥胖密切相关。新兴的代谢性炎症研究表明,肥胖属于一种全身慢性低度炎症状态,这种状态主要与脂肪组织炎症状态有关,而脂肪组织炎症又是肥胖相关疾病的重要驱动因素。IL-17是辅助性T细胞Th17细胞分泌的主要炎性因子,在炎症及免疫相关疾病的发生发展中发挥关键作用,已成为近年来炎症性疾病讨论和研究的热点。目前有关IL-17在BPA诱导肥胖中对脂肪组织炎症影响及调控作用仍然不清楚。研究目的通过动物实验探讨环境相当剂量的BPA暴露对小鼠脂肪组织炎性细胞浸润、炎症细胞因子表达、IL-17表达和Th17细胞比例的影响,并用IL-17抗体下调IL-17,探讨IL-17对BPA暴露诱导小鼠脂肪组织炎症的调控作用。为制定环境BPA暴露健康危害的防治措施和策略提供实验资料依据。研究方法第一部分:BPA暴露诱导小鼠脂肪组织炎症中IL-17表达的研究4周龄C57BL/6J野生型雄性小鼠随机分为溶剂对照组、10nM BPA组、100nM BPA组和1000nM BPA组,每组48只小鼠。每组分别用普通饮食(ND)和高脂饮食(HFD)各喂养24只。小鼠通过饮水摄入BPA,分别于暴露8周、12周、16周和20周时处死6只动物,取附睾脂肪垫进行后续实验。第二部分:IL-17抗体对BPA诱导的小鼠脂肪组织炎症的影响4周龄C57BL/6J野生型雄性小鼠随机分为非BPA暴露组和BPA暴露组,BPA暴露组小鼠通过饮水摄入1000nM BPA,所有小鼠均用HFD喂养,每组中再分别设立溶剂对照组、IgG同型对照组和IL-17抗体处理组,每组16只小鼠。IgG同型对照组和IL-17抗体处理组每周分别腹腔注射100μg IgG和100μg IL-17抗体一次。分别于处理8周和16周后处死小鼠,取附睾脂肪垫进行后续实验。用组织病理学观察附睾脂肪组织炎性细胞浸润情况,用免疫组化和酶联免疫吸附试验检测脂肪组织炎性因子IL-17、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达和含量,用RT-PCR检测IL-17 m RNA水平,用流式细胞术分析SVF中Th17细胞比例。结果1.BPA暴露对小鼠体重的影响与溶剂对照组相比,BPA暴露组ND喂养和HFD喂养小鼠体重均呈现时间和剂量依赖性增加。在ND喂养小鼠中,与溶剂对照组相比,小鼠体重增加在100nM BPA暴露组和1000nM BPA暴露组,分别从19周和12周开始,差异具有统计学意义(P<0.05);在HFD喂养小鼠中,与溶剂对照组相比,小鼠体重增加在100nM BPA暴露组和1000nM BPA暴露组,分别从15周和11周开始,差异具有统计学意义(P<0.05)。与ND喂养相比,BPA对HFD喂养小鼠体重增加的影响更明显。2.BPA暴露对小鼠脂肪组织炎症的影响2.1脂肪组织炎症的组织病理学观察结果与ND喂养小鼠相比,HFD喂养小鼠脂肪组织脂肪细胞变大,炎性浸润增多;与各自溶剂对照组相比,ND和HFD喂养小鼠中,脂肪组织脂肪细胞变大和炎性浸润增多均呈时间和BPA暴露剂量依赖性,在HFD喂养小鼠中更明显。2.2脂肪组织细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6免疫组织化学检测结果与ND喂养小鼠相比,HFD喂养小鼠脂肪组织TNF-α、IL-1β和IL-6表达明显增强,与溶剂对照组相比,BPA暴露组小鼠脂肪组织中TNF-α、IL-1β和IL-6表达都呈现时间和剂量依赖性增强,在HFD喂养小鼠中更明显。2.3脂肪组织细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量ELISA检测结果与ND喂养小鼠相比,HFD喂养小鼠脂肪组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高;与溶剂对照组相比,BPA暴露组小鼠脂肪组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量呈现时间和剂量依赖性升高。在ND喂养小鼠中,与溶剂对照组相比较,TNF-α和IL-6含量升高在100nM BPA组和1000nM BPA组从12周开始,在10nM BPA组从16周开始,差异具有统计学意义(P<0.05);IL-1β含量升高在1000nM BPA组从12周开始,在100nM BPA组从16周开始,在10nM BPA组从20周开始,差异具有统计学意义(P<0.05)。在HFD喂养小鼠中,与溶剂对照组相比较,TNF-α含量升高在1000nM BPA组从8周开始,在100nM BPA组和10nM BPA组从12周开始,差异具有统计学意义(P<0.05);IL-6含量升高在1000nM BPA组和100nM BPA组从8周开始,在10nM BPA组从12周开始,差异具有统计学意义(P<0.05);IL-1β含量升高在1000nM BPA组从8周开始,在100nM BPA组从12周开始,在10nM BPA组从16周开始,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.BPA暴露对小鼠脂肪组织IL-17的影响3.1脂肪组织IL-17表达IHC检测结果与ND小鼠相比,HFD喂养小鼠脂肪组织IL-17表达明显增加,与溶剂对照组相比,BPA暴露组脂肪组织IL-17表达呈时间和剂量依赖性增加,在HFD喂养小鼠中更明显。3.2脂肪组织IL-17 m RNA表达RT-PCR检测结果与ND喂养小鼠相比,HFD喂养小鼠脂肪组织IL-17 m RNA的表达上调;与溶剂对照组相比,BPA暴露组脂肪组织IL-17 m RNA表达呈时间和剂量依赖性上调。在ND喂养小鼠中,与溶剂对照组相比,IL-17 m RNA表达上调在1000nM BPA和100nM BPA组从12周开始,在10nM BPA组从20周时,差异具有统计学意义(P<0.05);在HFD喂养小鼠中,与溶剂对照组相比较,IL-17m RNA表达在1000nM BPA组和100nM BPA组从12周开始,10nM BPA组从16周开始,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.3脂肪组织IL-17含量ELISA检测结果与ND喂养小鼠相比,HFD喂养小鼠脂肪组织IL-17含量升高;与溶剂对照组相比,BPA暴露组脂肪组织IL-17含量呈时间和剂量依赖性升高。在ND喂养小鼠中,与溶剂对照组相比较,IL-17含量升高在1000nM BPA组和100nM BPA组从16周开始,在10nM BPA组从20周时,差异具有统计学意义(P<0.05);在HFD喂养小鼠中,与溶剂对照组相比较,IL-17含量升高在1000nM BPA组和100nM BPA组从12周开始,在10nM BPA组从16周开始,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.BPA暴露对小鼠附睾脂肪组织中Th17细胞比例的影响与ND喂养小鼠相比,HFD喂养小鼠脂肪组织中Th17细胞比例升高;与溶剂对照组相比,BPA暴露组脂肪组织Th17细胞比例呈现时间和剂量依赖性升高。在ND喂养小鼠中,与溶剂对照组相比较,Th17细胞比例升高在1000nM BPA组从12周开始,在100nM BPA组从16周开始,在10nM BPA组从20周时,差异具有统计学意义(P<0.05);在HFD喂养小鼠中,与溶剂对照组相比较,Th17细胞比例升高在1000nM BPA组和100nM BPA组从12周开始,在10nM BPA组从20周时,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.IL-17抗体对BPA暴露诱导的小鼠脂肪组织IL-17表达的影响IL-17表达在1000nM BPA暴露组中要比非BPA暴露组中高,在非BPA暴露组和1000nM BPA暴露组中,IgG处理对IL-17表达没有明显影响;与各自IgG同型对照相比,IL-17抗体处理HFD喂养小鼠,脂肪组织IL-17表达在非BPA暴露组内,以及1000nM BPA暴露组内均明显减少,而且1000nM BPA暴露组减少较非BPA暴露组更明显,表明IL-17抗体可以有效降低BPA暴露诱导的脂肪组织中IL-17水平。6.IL-17抗体对BPA暴露小鼠脂肪组织Th17细胞比例的影响Th17比例在1000nM BPA暴露组中要比非BPA暴露组中高,在非BPA暴露组和1000nM BPA暴露组中,IgG处理对Th17比例没有明显影响;与各自IgG同型对照相比,IL-17抗体处理使得Th17比例有下调趋势,但是没有统计学意义(P>0.05)。7.IL-17抗体对BPA暴露诱导的小鼠体重增加的抑制作用1000nM BPA暴露组小鼠体重和附睾脂肪垫系数高于非BPA暴露组;在非BPA暴露组和1000nM BPA暴露组中,与各自的溶剂对照组相比较,IgG处理对小鼠体重和附睾脂肪垫系数影响不明显;与各自IgG同型对照相比,IL-17抗体处理使小鼠体重有下降的趋势,但是不具有统计学意义(P>0.05);与各自IgG同型对照相比,IL-17抗体处理使小鼠附睾脂肪垫系数有下降的趋势,但是在非BPA暴露组中不具有统计学意义(P>0.05),在1000nM BPA暴露组中具有统计学意义(P<0.05)。8.IL-17抗体对BPA暴露诱导的小鼠脂肪组织炎症的改善作用8.1脂肪组织病理学结果1000nM BPA暴露组炎性浸润要比非BPA暴露组严重;在非BPA暴露组中和1000nM BPA暴露组中,与各自的溶剂对照组相比较,IgG处理对炎性浸润影响不明显;与各自IgG同型对照相比,IL-17抗体处理使炎性浸润减轻。8.2小鼠脂肪组织TNF-α、IL-1β和IL-6的组化结果TNF-α、IL-1β和IL-6的表达在1000nM BPA暴露组中的表达要比非BPA暴露组中的表达高,在非BPA暴露组中和1000nM BPA暴露组中,与各自的溶剂对照组相比较,IgG处理对TNF-α、IL-1β和IL-6的表达影响不明显;与各自IgG同型对照相比,IL-17抗体处理使得TNF-α、IL-1β和IL-6的表达明显下调。结论1低剂量BPA暴露可以促进小鼠脂肪组织炎性细胞浸润和炎性因子表达增加。2低剂量BPA暴露可以诱导小鼠脂肪组织IL-17表达上调和Th17细胞比例增加。3 IL-17抗体可以降低BPA暴露引起的小鼠脂肪组织中IL-17水平,但对Th17细胞数量没有显著作用;4.IL-17抗体可以改善BPA暴露引起的小鼠体重增加、脂肪组织炎性细胞浸润和炎性因子分泌。