目的:砷是环境中普遍存在的化学元素,是国际癌症研究属（IARC）确认的Ι类人类致癌物,能够引起皮肤癌、肺癌、膀胱癌和肝癌等。人主要是通过职业和饮用含砷地下水暴露于高砷环境中。由于砷在体内甲基化代谢后从尿中排出,以及肾脏对尿液的生物浓集的特点,膀胱暴露于浓度较高的多种砷化物中,由此可以看出,相对于其他脏器,膀胱癌的发生风险可能更大。但是目前我们对砷致膀胱癌的机制仍不清楚。上皮细胞间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指上皮细胞通过一系列细胞程序转化为具有间充质细胞表型的生物学过程,并获得迁移的能力,是早期膀胱癌生成、细胞侵袭和转移的基础。与肿瘤相关的EMT,其主要表现为:上皮细胞失去细胞极性,细胞间黏附作用减弱,如角蛋白（Keratin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）等细胞黏附分子表达下降,间质细胞表型蛋白表达增强,如波形蛋白（Vimentin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）等。EMT为我们进一步对砷致膀胱癌的机制研究提供了新思路。转化生长因子（transforming growth factor-β,TGF-β）是一类影响细胞增殖、分化、凋亡、黏附和迁移的细胞因子。TGF-β/Smad信号通路是重要的影响EMT的通路。TGF-β与细胞膜上的TGF-βI型受体（TβRI）和TGF-βII型受体（TβRII）结合后,激活Smad2和Smad3,并与Smad4结合形成三聚体进入细胞核,与转录因子SNAIL1、SNAIL2、ZEB结合,诱导E-cadherin表达下降,N-cadherin、Vimentin表达升高,促进EMT发生。microRNA（miRNA）能够靶向调控多种EMT相关蛋白。miR-200家族是典型阻碍EMT发生的miRNA,包括5个成员（miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429）。其中miR-200c被认为是EMT过程中最重要的调节因子,是抑制EMT及许多恶性肿瘤发生侵袭和转移的关键因素。因此,本研究拟测定长期低剂量砷暴露诱导人正常膀胱上皮细胞（SV-HUC-1）EMT相关因子（E-cadherin、Vimentin）和TGF-β/Smad信号通路相关因子表达的变化情况,以典型抑制EMT过程的miR-200家族中miR-200c为研究对象,初步探索miR-200c和TGF-β/Smad信号通路在慢性砷暴露诱导人膀胱上皮细胞EMT过程中调控的机制。实验方法:1、细胞培养:细胞培养一切具体过程均在生物安全柜内严格无菌操作,SV-HUC-1以含血清、青霉素、链霉素的F12K完全培养基培养、5%CO₂恒温培养箱孵育。染毒组用0.5μmol/L NaAsO₂完全培养液长期染毒。当培养皿底面铺满80%的细胞时,用适量的EDTA溶液消化传代。根据细胞的实际量按照1:3的比例冻存留用,如此培养至40周（大概80代）。2、细胞形态学观察、MTT实验:每隔10代将对照组和染毒组的细胞形态进行拍照记录,EDTA消化对数期细胞,细胞计数调整其浓度至5-10×10⁴/ml。96孔培养板每孔加100ul细胞悬液,边缘孔用无菌PBS填充。向培养液中加入MTT溶液,培养箱孵育。酶标仪于490 nm处测定各孔吸光度（OD）值。细胞活力用MTT的还原率表示。3、Transwell细胞迁移实验:取对数生长的各代细胞,细胞悬液密度调至4×10⁵/ml,24孔板中加入600μl完全培养液作为下室,放入上室,加200μl细胞悬液。孵育隔夜,将上室取出,PBS沿上室室壁冲洗。多聚甲醛固定,PBS同上洗涤,擦拭未迁移的细胞。0.1%结晶紫染色15min,PBS洗涤2次。上室浸润在PBS里,显微镜拍照。用33%醋酸脱色,将结晶紫完全洗脱下来。取200μl洗脱液加入96孔板中,室温震荡,使用酶标仪在570 nm处测定其OD值,间接反应细胞数。4、细胞划痕实验:6孔板背面每隔0.5-1cm用直尺笔着均匀画直线,每孔至少5条线。将细胞接种至6孔板中,利用自动细胞计数仪每孔按5×10⁵个接种,过夜后细胞铺满为宜。隔天用枪头比着直尺,垂直于背面的横线划痕。用PBS轻轻冲洗细胞3次,加入无血清的培养基。放入培养箱,按0,6,12,24h拍照,拍照时需选择与第一次拍照相同的视野进行拍照,每孔拍照不低于四张,划痕融合率=（24h细胞迁移距离/划痕总距离）×100%计算细胞迁移率。5、软琼脂集落形成实验:取对数生长期的各代细胞,将细胞密度调至1×10⁶个/L。PBS分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低熔点琼脂糖液,高压灭菌。1.2%的琼脂糖液和2xF12K完全培养基1:1混合,作为底层琼脂。0.7%的琼脂糖和2xF12K培养基在试管中1:1混匀,再加入细胞悬液,充分混匀,注入底层平皿中,形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入恒温箱中培养21天。经常观察,每7天拍照一次。在低倍显微镜下计数大于50个细胞的细胞团数。6、RNA提取和Real-time PCR检测:根据文献和专用设计软件Primer 5设计并合成对应的mRNA引物,经长期染毒处理的细胞用常规方法提取细胞内总RNA,并于-80℃冰箱保存。以DEPC水为空白对照测定260nm/280nm分光光度法测量RNA浓度和纯度。反转录、实时荧光定量检测,应用Q6 Real-Time PCR System进行扩增,计算Ct值。采取比较Ct法（△△Ct法）计算转录水平差异。7、Western blot免疫印迹方法检测蛋白表达:按照试剂盒说明书提取总蛋白,采用BCA测定所提取的蛋白浓度,-80℃保存。采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜至PVDF膜;封闭后加入一抗孵育,使其与靶蛋白结合;洗脱后加入荧光二抗孵育,洗去未结合的荧光二抗;曝光、扫描、定量分析。结果:1、长期砷处理对SV-HUC-1细胞发生EMT的影响,随NaAsO2处理时间的延长,细胞由连接紧密的扁平多变形状向松散的长梭型转变;0.5μmol/L NaAsO₂处理至20周后,细胞活力显著增强,与处理10周时比较差异有统计学意义（P<0.01）;划痕愈合实验显示,砷处理20周后,痕愈合面积也显著高于10周时（P<0.01）;砷处理30周后,transwell细胞迁移能力显著高于10周时（P<0.01）;软琼脂集落形成实验显示,砷处理30周后软琼脂上出现大量明显的锚定生长集落,砷处理20周、30周、40周组集落形成数量分别为10周组的1.85倍、9.79倍（P<0.01）和15.36倍（P<0.01）,未经砷处理组各代数组无集落生成。随砷处理时间延长,与对照组相比,E-cadherin表达逐渐降低、Vimentin表达逐渐升高,并呈一定的时间-效应关系。2、长期砷处理对SV-HUC-1细胞TGF-β1/Smad信号通路活化的影响,SV-HUC-1细胞经0.5μmol/L NaAsO₂处理40周后,与非砷处理组相比,TGF-β1、p-Smad 2、p-Smad 3蛋白的表达水平均升高（P<0.05）,且Smad 2和Smad 3表达水平未发生变化。Western-blot检测EMT相关因子蛋白表达水平,TGF-β1抑制剂处理组E-cad表达水平与DMSO组、R40周组差异明显、表达水平明显升高（P<0.05）,Vimentin表达趋势相反。3、长期砷处理对SV-HUC-1细胞miR-200c的影响,SV-HUC-1细胞经NaAsO₂0.5μmol/L处理40周后,Realtime-PCR检测miR-200c表达水平,与非砷处理组相比,R40周组miR-200c表达降低。转染miR-200c mimic致长期砷处理40周的SV-HUC-1细胞中,miR-200c的表达水平较未转染组和转染miR-NC mimic组明显提高。Western-blot检测EMT相关因子蛋白表达水平,转染miR-200c mimic组E-cad表达水平与转染NC mimic组和R40周组差异明显、表达水平明显升高（P<0.05）,Vimentin表达趋势相反。4、TGF-β1调控miR-200c在长期砷处理所致SV-HUC-1细胞中的作用,经qPCR法检测三组细胞中miR-200c表达水平,与R40周组比较,DMSO组差异不大,TGF-β1抑制组miR-200c表达显著增高。结论:1、0.5μmol/L NaAsO₂长期处理的SV-HUC-1细胞可逐渐恶转,诱导膀胱上皮细胞发生EMT。2、NaAsO₂长期处理可激活SV-HUC-1细胞TGF-β1/Smad2/3信号通路,TGF-β1参与了砷诱导的SV-HUC-1细胞EMT转化过程。3、长期砷处理可以使SV-HUC-1细胞中miR-200c水平降低。4、TGF-β1通过miR-200c介导砷诱导的SV-HUC-1细胞EMT转化。