青蒿琥酯(ART)是一种含有倍半萜结构抗疟药青蒿素的衍生物,其治疗疟疾疗效好且毒副作用小。研究表明,除抗疟作用外,青蒿素类药物还具有免疫调节、抗炎、抗菌增敏、抗肿瘤等多种药理活性作用。但水溶性差、半衰期短、生物利用度低等缺点限制了青蒿素类药物在多种疾病中的应用。肺炎在世界范围内均具有高发病率和高病死率,其初始治疗以经验性为主,治疗主要使用广谱抗菌素,这导致了抗菌药物耐药状况的恶化,给肺炎的治疗带来了挑战。因此,本研究希望通过聚乙二醇单甲醚(mPEG)修饰ART制备成具有两亲性的PEG化ART前药(PEG-ART),并对其理化性质、体内外抗LPS诱导肺炎作用进行评价,以期拓展ART在治疗肺炎方面的潜在效用。第一章介绍了 PEG化ART前药的制备及性能研究:采用聚乙二醇单甲醚(mPEG,Mw=2000和Mw=5000)对ART进行化学修饰,通过一步酯化反应合成PEG化ART前药mPEG-ART;同时,通过双(2-羟基乙基)二硫醚引入二硫键,得到具有氧化还原响应性的产物mPEG-SS-ART。修饰后的两亲性聚合物mPEG-ART及mPEG-SS-ART可通过疏水亲水作用在水溶液中自发组装,形成分布较窄的纳米胶束。利用核磁共振氢谱(1H-NMR)表征产物的结构;高效液相色谱(HPLC)法测定ART前药中ART的含量;芘荧光探针法测定各ART前药聚合物的临界胶束浓度(CMC);透射电镜观察各ART前药的形貌;激光粒度仪测定各ART前药聚合物在去离子水溶液和磷酸盐缓冲溶液中的粒径分布情况并考察各ART前药胶束在室温和37℃C下的稳定性;采用透析法考察各ART前药中ART的体外释放性能。本文成功合成4种ART前药,分别为mPEG2000-ART、mPEG5ooo-ART、mPEG2000-SS-ART 和 mPEG5o00-SS-ART(以下结果均以此顺序为准),1H-NMR验证其结构,并根据ART的质子位移5.4 ppm(e,单峰)和mPEG的甲基质子信号3.4 ppm(v,单峰)的积分比,计算得到ART前药中mPEG与ART的比例分别为1.5:1,1.0:1,1.2:1和1.4:1。HPLC测定聚合物中ART的含量结果分别为(5.72±0.55)%、(2.88±0.19)%、(3.08±0.41%)和(1.37±0.33)%。mPEG2000-SS-ART 和 mPEG500-SS-ART 的临界胶束浓度分别为 0.072 mg mL-1、0.256 mg mL-1;mPEG2000-ART 和 mPEG5000-ART 未测得 CMC 值。各 ART 前药聚合物在水溶液中自发形成球形或类球形胶束,mPEG2000-ART、mPEG500-ART胶束的粒径分布较集中,平均粒径分别为3.72±0.49nm和5.18±0.13nm,与透射电镜图结果相符;mPEG2000-SS-ART胶束平均粒径为41.04±6.97 nm;mPEG5000-SS-ART胶束粒径分布范围较大且呈双峰分布,平均粒径为106.35±9.13 nm。稳定性结果显示,PEG2000-ART和PEG5000-ART在室温下48小时内稳定,在 37℃C下 72 小时内稳定;PEG2000-SS-ART 和 PEG5000-SS-ART 在室温和 37℃下均在12小时内比较稳定,然后粒径先增大后减小,说明其结构可能发生了变化。体外释放结果为PEG2000-ART在含酯酶条件下快速释放,8 h累积释放量达74.3%,在不含酯酶条件下累计释放量仅为27.1%;PEGsooo-ART的释放曲线在含酯酶和不含酯酶条件下的释放速率和累积释放量相近,最大累积释放量分别为55.6%和52.1%,这可能是由于PEG5000较长的分子链形成的线团结构阻止了酯酶水解酯键。PEG2000-SS-ART表现出较好的氧化还原响应性,在含GSH条件下24 h达最大累积释放量为69.3%;在不含GSH条件下释放速率较慢,4 h便达到最大累积释放量仅为26.8%;与不含GSH条件相比较,PEG5000-SS-ART在含GSH条件下释放速率快,且累积释放量由34.3%增加到47.2%;总体上PEG2000-ART、PEG2000-SS-ART 的体外释药性能优于 PEG5000-ART、PEGsooo-SS-ART。以上结果表明4种ART前药各有优势,均显著提高了 ART的水溶性,其较小的粒径有利于提高体内循环时间,更好发挥药效。第二章介绍了 ART前药体内外抗LPS诱导肺炎作用研究:本章分为两部分,体外细胞实验选用LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7作为炎症细胞模型,RAW264.7细胞中加入不同浓度游离ART和4种ART前药预处理1小时,再加入200 ng·mL-1的LPS刺激6小时,收集上清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞释放肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)的含量。TNF-α、IL-6和IL-1β检测结果均显示:与control组相比,LPS刺激可显著增加细胞中三种炎症因子的表达;而在各种ART药物预处理情况下,三种炎症因子的表达随药物浓度增大呈下降的趋势,说明ART前药可抑制LPS诱导细胞释放炎症因子,体外具有抗炎作用。其中,PEG2000-SS-ART前药抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放炎症因子的效果最好,且10 μg mL-1的剂量即可达到较好效果。体内药效学评价利用小鼠鼻内滴入LPS建立小鼠肺炎模型;小鼠在造模前1小时给予游离ART和各ART前药,然后鼻内滴入LPS(25μg/25μL),6小时后进行肺灌注收集肺泡灌注液(BALF),用于总细胞和中性粒细胞计数,ELISA检测肺灌注液中TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子的表达情况;收集肺组织,利用湿/干重比检测肺组织水肿差异程度;另收集肺组织并均质化以获得匀浆,检测MPO活性;通过H&E染色观察肺组织形态及炎症损伤;DTNB 比色法测定LPS诱导的RAW264.7细胞和小鼠BALF及肺组织中GSH含量。结果表明成功建立LPS诱导的小鼠肺炎模型,与正常小鼠相比,LPS处理组小鼠的BALF中性粒细胞数量明显增多,肺组织湿/干重比例显著升高,肺组织的H&E染色结果显示炎性细胞浸润增加,MPO活性及TNF-α,IL-1β和IL-6炎症因子表达水平均显著升高;而经不同ART药物处理组则不同程度的降低了肺组织湿/干重比例,减少炎症细胞浸润,以及降低肺匀浆MPO活性和TNF-α,IL-1β和IL-6炎症因子的表达水平;DTNB 比色法测定GSH含量结果显示,游离ART和PEG2000-SS-ART可以提高LPS诱导RAW264.7细胞和小鼠BALF及肺组织中GSH含量,这可能是ART药物发挥抗炎作用的机制之一。体内外抗炎评价结果说明制备的ART前药有利于预防LPS诱导的急性肺损伤(ALI),其中,PEG2000-SS-ART的多项考察指标优于游离ART。第三章对各ART药物的大鼠体内药代动力学进行了研究。建立了大鼠血浆中ART和双氢青蒿素(DHA)的UPLC/MS分析方法;对大鼠单次尾静脉注射药物后在特定的时间点取血,分析血浆中ART和DHA的浓度,绘制药时曲线,并用DAS软件分析其药代动力学参数。大鼠体内ART含量结果表明,PEG2000-SS-ART相对于游离药,其血浆清除率降低,消除半衰期延长,且各项参数均优于其它三种ART前药;大鼠体内DHA含量结果表明,游离药和各ART前药均在15 min达血药浓度峰值,说明ART在体内可以迅速代谢为其活性成分DHA;与游离药相比,PEG2000-ART和PEG5000-ART提高了 AUC值,降低了清除速率,可以延长DHA的大鼠体内循环时间。