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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是一种已知的能够感染哺乳类动物的最小病毒,是引起猪圆环病毒病(Porcine circovirus associated diseases,PCVAD)的病原体。PCV2是一种无囊膜病毒,属于圆环病毒科(Circoviridae)的圆环病毒属(Circovirus),其基因组是一种单链闭合环状的双义的不分节的DNA。该病毒曾经被预测含有11个开放阅读框,其中4个已经被鉴定能够编码该病毒的蛋白。它们分别是ORF1编码病毒的复制酶相关蛋白Rep和Rep’,ORF2编码病毒的衣壳蛋白Cap,ORF3编码病毒的促凋亡蛋白ORF3蛋白以及ORF4编码病毒的抗凋亡蛋白ORF4蛋白(尽管该蛋白的抗凋亡机制尚不清楚)。序列比对分析发现Hamel等曾预测的ORF5基因(nt1016-1177)并不存在,这是因为该假定的蛋白在一些PCV2中国分离株中翻译至第7个氨基酸就提前终止了。然而,许多学者在对不同PCV2毒株序列比较时发现该病毒的基因组中有一段基因(nt553-732)高度保守,推测其很可能编码病毒的某个蛋白,甚至还各自为这个未知蛋白起了名字(如基因序列号O92288、Q77GS3、Q77S04等)。为了探究该蛋白(本文将其命名为ORF5蛋白)存在与否,其所编码产物的性质和功能,以及ORF4蛋白拮抗细胞凋亡的分子机制,开展了研究工作,获得了以下结果:(1)基因与蛋白水平验证PCV2 ORF5蛋白的存在。PCV2杨凌株感染猪肺泡巨噬细胞3D4/2(Porcine alveolar macrophages,PAMs)后,通过RT-PCR和Northern blot的检测发现,ORF5基因能够在PCV2复制过程中转录,其转录本约为180 bp,完全镶嵌在ORF1的内部且与ORF1转录方向一致。此外,借助制备的鼠抗ORF5蛋白多克隆抗体(包括利用GST-ORF5融合蛋白、化学合成法得到的ORF5抗原表位多肽以及真核表达质粒pcDNA-ORF5为抗原免疫Balb/c小鼠制备的多克隆抗体),可在ORF5基因转染的PAM中检测到Western blot信号,也可在PCV2感染的PAM中检测到IFA信号,说明PCV2感染过程中存在ORF5基因编码的病毒蛋白,即ORF5蛋白。尽管如此,ORF5蛋白在翻译水平的表达还需要进一步验证,毕竟Western blot未能检测到特异性ORF5蛋白条带。研究结果分别从基因与蛋白水平初步验证了PCV2 ORF5基因的转录和翻译,为后续该蛋白性质和功能的研究奠定了基础。(2)PCV2 ORF5蛋白功能的研究。为了分析PCV2 ORF5蛋白的功能,构建了缺失ORF5蛋白的PCV2感染性克隆(PCV2Δ),经过对其复制动力学分析发现ORF5蛋白并不是pcv2复制所必需的病毒蛋白。利用拯救出的orf5蛋白缺失体病毒pcv2Δ,重组型病毒rpcv2以及野生型病毒wpcv2分别感染pam后用实时荧光定量pcr方法(rt-qpcr)分析orf1、orf2、orf3、orf4和orf5mrna的表达曲线,结果发现orf5基因在病毒感染细胞后约48h表达量最高,而且起始密码子的突变并不影响orf5基因的转录,提示orf5基因转录的起始位点可能位于更上游的位置。此外,pcv2Δ感染后的orf1和orf2mrna表达量较wpcv2和rpcv2都有显著下降趋势,表明orf5蛋白的缺失可能会影响病毒orf1和orf2基因的转录进程。为了进一步分析orf5蛋白在pcv2感染过程中的作用,构建了orf5蛋白的真核表达载体pegfp-orf5,转染pam细胞后检测该蛋白对pam细胞生理功能的影响,结果发现gfp标记的orf5蛋白能够通过蛋白酶体途径被降解,能够抑制pam细胞的增殖,延长pam细胞周期的s期,定位在内质网并引起细胞内质网应激,激活nf-κb并上调其下游基因的表达。但是,由于gfp-orf5蛋白的功能可能并不能完全代表orf5蛋白自身的功能,因此有关orf5蛋白功能的描述还需要进一步的证实。(3)pcv2orf4和orf5蛋白胞内互作蛋白的筛选。为了筛选pcv2orf4和orf5这两个新型病毒蛋白在宿主细胞内的互作蛋白,构建了猪肺泡巨噬细胞的cdna文库,分别利用pcv2orf4和orf5蛋白为诱饵蛋白通过酵母双杂交的方法筛选出了与pcv2orf4蛋白互作的4个蛋白(fhc,snrpn,cox8a和laminc)和与pcv2orf5蛋白互作的5个蛋白(gpnmb,cyp1a1,ywhab,znf511和srsf3)。(4)pcv2orf4蛋白拮抗细胞凋亡机制的研究。pcv2orf4蛋白曾被推测为抗凋亡蛋白,但迄今为止关于该蛋白抗凋亡的具体机制尚不明确。为了澄清这一问题,选择上述酵母双杂交结果中的重链铁蛋白(fhc)为出发点,先通过gstpull-down和co-ip分别在细胞外和细胞内验证orf4蛋白与fhc能够相互结合,后又用激光共聚焦技术在细胞水平证明orf4蛋白与fhc蛋白在hek293t细胞中存在共定位现象,表明pcv2orf4蛋白与宿主fhc蛋白存在相互作用。考虑到fhc具有抗凋亡的作用且该作用具有剂量依赖性,首先用过表达(lv-fhc)和基因干扰(sh-fhc)的方法证实fhc参与了pcv2诱导的凋亡,然后用过表达(gfp-orf4)和基因缺失(感染性克隆pcv2Δ)的方法证实orf4蛋白虽然不能影响宿主细胞fhc基因的转录,但却能够通过某种方式的蛋白修饰降低细胞内具有生物活性的fhc蛋白的浓度,提示pcv2orf4蛋白很可能通过稳定宿主细胞内fhc蛋白水平的恒定而发挥抗凋亡的作用。综上所述,本研究初步证实了pcv2orf5蛋白是病毒复制的非必需蛋白,但是gfp标记的orf5蛋白却能够通过延长细胞周期的s期而抑制细胞的增殖,能够定位在内质网并且可诱导细胞内质网应激,能够激活nf-κb并上调其下游基因;orf5蛋白可与细胞内的gpnmb、cyp1a1、ywhab、znf511和srsf3互作。orf4蛋白能够与细胞内的fhc、snrpn、cox8a和laminc互作,其中orf4蛋白能够通过与宿主fhc互作而维持细胞内FHC蛋白水平的恒定,从而发挥拮抗细胞凋亡的作用,为病毒的早期复制提供帮助。