背景与目的尽管儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）总体生存率已达80%-90%,但仍有15%-20%的ALL患儿出现复发。复发的根源之一是微小残留病（MRD）存在,为有效清除MRD,提高ALL患儿长期无病生存率,本课题组前期体外研究显示胞壁酰二肽-抗CD10偶联物（MDP-anti CD10偶联物）具有靶向及免疫增强作用,为进一步验证体内抗白血病作用,故本实验通过建立ALL裸鼠模型,采用不同给药方式、给予相同剂量的MDP-anti CD10偶联物及相同数量的人淋巴细胞,探讨其对ALL裸鼠的抗白血病作用及可能的机制。方法1.细胞培养、传代及冻存:将Nalm-6细胞置于含15%胎牛血清的RPIM-1640完全培养基中,并于37℃,含5%CO2的培养箱中培养,待细胞生长至细胞密度约为25cm3培养瓶的90%时进行细胞传代或冻存。2.ALL动物模型的建立:选取24只裸鼠（BALA/c-nu鼠）进行皮下造模,取0.2ml细胞浓度为（2-3）×107个/0.2ml的Nalm-6细胞皮下注射。（11.0±2.5）d后可于注射部位肉眼见到（3-4）×（3-4）mm大小的肿物。通过外周血及骨髓进行特殊染色,同时骨髓还需做人源CD10（h CD10）和人源CD19（h CD19）的免疫组化,留取肝脏、脾脏制作病理切片分别进行h CD19、h CD10免疫组化,观察ALL裸鼠是否存在远处转移。3.实验分组:将实验组随机分为五组,每组4只,分别为A组（静脉注射MDP-anti CD10偶联物,腹腔注射人淋巴细胞）、B组（瘤内注射MDP-anti CD10偶联物,腹腔注射人淋巴细胞）、C组（瘤内注射MDP-anti CD10偶联物,瘤内注射人淋巴细胞）、D组（瘤内注射人淋巴细胞）、E组（瘤内注射PBS）。同时选取4只同周龄的裸鼠作为正常对照组,即O组。4.ALL裸鼠一般情况及生长曲线:每天观察并记录所有组裸鼠的活动、饮食、瘤体大小以及体重变化,并绘制移植瘤生长曲线。5.注射药物及人淋巴细胞:按Ficoll-Hypague法提取人外周血中的淋巴细胞;并按实验分组分别注射人淋巴细胞（0.2ml,1×106个/0.2ml）或/及药物MDP-anti CD10偶联物（0.2ml,20ug/0.2ml）。6.γ-干扰素（IFN-γ）测定:用ELISA法测定所有组裸鼠血清中的IFN-γ水平。7.移植瘤病理检查:HE染色观察组织细胞的形态,通过免疫组化测定移植瘤中是否存在人源CD4（h CD4）、人源CD8（h CD8）、人源CD19（h CD19）、人源CD10（h CD10）、鼠源CD14（m CD4）、鼠源CD56抗原（m CD56）。结果1.成功建立ALL模型:皮下注射Nalm-6细胞,（11.0±2.5）d后,注射部位肉眼可见（3-4）×（3-4）mm大小的肿物。外周血中未找到白血病细胞;骨髓涂片中可见白血病细胞,大细胞性,胞核大、浅染。骨髓免疫组化结果示骨髓白血病细胞h CD19（+）、h CD10（+）;肝脏及脾脏HE染色示肝脾组织正常结构破坏,免疫组化显示h CD19（+）、h CD10（+）。2.ALL裸鼠的一般情况:造模前后白血病裸鼠的活动、饮食无明显变化,无便血,无尿血;与造模前的体重相比,第15d的体重下降由高到低分别为E组（5.50±0.44）g、D组（4.70±0.35）g、A组（3.77±0.42）g、B组（2.80±1.04）g、C组（1.27±0.93）g,其中C组ALL裸鼠第15d的体重下降最少。各组的体重变化比较差异具有显著统计学意义（F=16.82,P<0.05）,C组与其他各组间均有统计学意义（P<0.05）。3.移植瘤生长曲线:不同实验组白血病裸鼠的移植瘤生长程度不同,与第1d相比,第15d C组ALL裸鼠的移植瘤体积显著减小,减小（53.04±7.20）mm3;B组ALL裸鼠移植瘤的体积逐渐减小,在第10d后开始增大,第15d移植瘤体积减小不大,仅减小（3.65±2.90）mm3;A组、D组、E组移植瘤体积均逐渐增加,以E组增加最为明显,增加（695.77±13.92）mm3。各组间移植瘤体积变化比较差异具有统计学意义（F=5062.60,P<0.05）,各组间两两比较均有统计学意义（P<0.05）;各组间移植瘤体积变化比例比较差异具有统计学意义（F=701.17,P<0.05）,各组间两两比较均有统计学意义（P<0.05）。采用重复度量统计学方法比较不同实验组移植瘤体积差异具有明显的统计学意义（F=3462.65,P<0.01）,不同时间移植瘤体积差异具有明显的统计学意义（F=5212.04,P<0.05）,不同处理方式与测量时间存在交互效应（F=3141.54,P<0.01）,各实验组组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。4.血清IFN-γ浓度:对照组血清IFN-γ浓度为（199.85±13.28）ng/L,各实验组IFN-γ浓度显著增高。浓度由高到低分别为C组（1850.5±91.91）ng/L、B组（1704.23±84.70）ng/L、A组（1558.04±28.22）ng/L、D组（1430.61±40.68）ng/L、E组（1210.20±41.65）ng/L,其中C组明显高于其他各实验组。各组IFN-γ浓度比较差异具有显著统计学意义（F=423.84,P<0.05）,各组组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。5.移植瘤免疫组化染色（1）移植瘤中h CD4的阳性率表达由高到低分别是C组（2.63±0.13）%、B组（0.66±0.02）%、D组（0.38±0.01）%、A组（0.20±0.02）%、E组（0.01±0.003）%,其中在C组的h CD4阳性率最高,各实验组h CD4阳性率比较差异具有统计学意义（F=917.20,P<0.05）,各实验组组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。（2）移植瘤中h CD8的阳性率表达由高到低分别是C组（6.57±1.12）%、D组（3.55±0.34）%、B组（2.45±0.19）%、A组（1.02±0.15）%、E组（0.02±0.002）%,其中在C组的h CD8阳性率最高,各实验组h CD8阳性率比较差异具有统计学意义（F=67.20,P<0.05）,各实验组组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）移植瘤中h CD19的阳性率表达由高到低分别是E组（35.99±2.67）%、D组（25.09±3.35）%、A组（18.04±1.69）%、B组（12.45±1.34）%、C组（8.19±1.01）%,其中在E组的h CD19阳性率最高,各实验组h CD19阳性率比较差异具有统计学意义（F=75.24,P<0.05）,各实验组组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。（4）移植瘤中m CD14表达的阳性率分别是A组（10.14±3.37）%、B组（8.70±1.03）%、C组（11.35±1.68）%、D组（8.64±1.27）%、E组（8.99±0.83）%,各实验组m CD14阳性率比较差异无统计学意义（F=1.16,P>0.05）。（5）移植瘤中m CD56表达的阳性率分别是A组（0.62±0.16）%、B组（0.86±0.58）%、C组（1.02±0.82）%、D组（0.49±0.18）%、E组（0.42±0.25）%,各实验组m CD56阳性率比较差异无统计学意义（F=0.86,P>0.05）。结论1.白血病裸鼠模型的肝脏、脾脏及骨髓中可见白血病细胞转移,提示Nalm-6细胞有较强的的侵袭性,白血病裸鼠的体重下降可能与白血病细胞的全身转移有关。2.MDP-anti CD10偶联物和具有活性的人淋巴细胞可以抑制移植瘤生长,具有抗白血病作用,其中瘤内注射方式比其他注射方式效果更显著。3.白血病裸鼠体内血清中的IFN-γ显著高于正常裸鼠,具有活性的人淋巴细胞和MDP-anti CD10偶联物均可以促进IFN-γ的分泌,两者联合瘤内注射时更强。4.瘤内联合注射MDP-anti CD10偶联物和人淋巴细胞可使肿瘤内富集CD4+和CD8+T淋巴细胞,提示MDP-anti CD10偶联物联合人淋巴细胞增强抗白血病的作用与人CD8+T淋巴细胞、人CD4+T细胞活化,并促进IFN-γ的产生有关。